血管紧张素Ⅱ促进小鼠胚胎干细胞定向分化成为血管平滑肌细胞的机制研究

发布时间：2019-10-10 22:38

【摘要】：本课题共分为三个部分第一部分：小鼠胚胎干细胞定向分化成为血管平滑肌细胞的模型建立研究目的：深入了解血管平滑肌细胞(VSMCs)发育及分化的特点对于了解血管疾病的过程非常重要。然而,目前对VSMCs特异分化及终末分化诱因的研究非常有限,原因之一是缺乏一种合适的VSMCs发育模型。胚胎干细胞为早期VSMCs的谱系形成、分化及成熟机制的研究提供了一种有价值的体外模型,而从胚胎干细胞单一、定向分化成为血管平滑肌细胞为将来的进一步研究其分化机制奠定基础。研究方法：将充满活力的小鼠胚胎干细胞D3系种植于Ⅳ型胶原包被的培养皿/板上,经过8天的诱导分化,取其中的2、4、6、8天各个点的细胞进行荧光定量PCR及免疫印迹试验,验证其平滑肌标志基因SMA、SM22、calponin、SM-MHC的表达水平。研究结果：Ⅳ型胶原成功诱导胚胎干细胞定向分化成为平滑肌细胞,平滑肌标志基因及蛋白可随诱导时间的增加而同步增加,最高峰在第8天。结论：利用Ⅳ型胶原的诱导分化,成功建立起胚胎干细胞单一、定向分化成为血管平滑肌细胞的体外模型,为进一步探讨其分化机制奠定基础。第二部分：血管紧张素Ⅱ促进小鼠胚胎干细胞定向分化成为血管平滑肌细胞研究目的：体内外实验均发现血管紧张素Ⅱ不仅仅是一个体液调节因子,它还是一种促血管新生的因子,可以刺激成血管细胞,包括内皮细胞及平滑肌细胞的生长、发育、分化及凋亡。本实验旨在探明AngⅡ在胚胎干细胞分化成为血管平滑肌细胞过程中本身所具有的生理作用。研究方法：采用在Ⅳ型胶原诱导分化过程中最有分化变化的第四天的干细胞,加入不同浓度的AngⅡ刺激(10-6-10-14mol/L)48小时后检测平滑肌标志基因SMA、 SM22、calponin、SM-MHC的基因及蛋白表达水平。同时对AngⅡ10-9mol/L组及对照组进行免疫荧光的染色比较。此外还分析了AngⅡ(10-6-10-10mol/L)的刺激是否与促进细胞增殖相关的MTT研究。研究结果：AngⅡ可以浓度依赖性的刺激上述标志基因的改变,在mRNA水平SMA、 SM22、calponin及SM-MHC的刺激最高峰处在10-9mol/L(p0.01),而在蛋白水平SMA、SM22及calponin的峰值在10-9mol/L(p0.01)。同时免疫荧光染色也显示出增强的标志基因SMA、SM22、calponin的荧光强度,但是SM-MHC的荧光改变不明显。此外AngⅡ不同浓度刺激下细胞增殖并未发生明显改变. 结论：AngⅡ可以浓度依赖性的刺激平滑肌标志基因的表达,从而可以促进胚胎干细胞分化成为血管平滑肌细胞,此促进分化的过程与促进细胞增殖无关。第三部分：血管紧张素Ⅱ促进小鼠胚胎干细胞定向分化成为血管平滑肌细胞的机制探讨研究目地：本部分通过对AngⅡ细胞外信号通路的探索,重点研究其促进分化过程中的主要参与部分,包括血管紧张素Ⅱ的受体及磷脂酰肌醇3激酶PI3K/Akt信号通路,同时探讨AngⅡ在转录因子水平对分化调控的可能参与因子。研究方法：Ⅳ型胶原诱导分化第四天的胚胎干细胞中,预先加入AngⅡⅠ型受体(AT1R)阻断剂氯沙坦(losartan)、AngⅡⅡ型受体(AT2R)阻断剂PD123319,及NF-κB抑制剂BAY11-7082,后给予AngⅡ10-9mol/L的刺激,检测平滑肌标志基因蛋白SMA及calponin的改变。PI3K/Akt信号通路研究上,主要通过AngⅡ不同浓度(10-6-10-10mol/L)刺激下检测相关的PI3K下游磷酸化Akt的变化；同时分析PI3K阻断剂LY294002作用下平滑肌标志基因蛋白SMA和calponin(?)及磷酸化Akt的改变。此外在转录水平检测AngⅡ不同浓度(10-6-10-10mol/L)对平滑肌标志基因SMA及SM22启动子活性的影响,及对相关转录因(?)(?)NF-Kappa B (NF-κB p50, p65), c-Jun等的作用。关于AngⅡ促进分化是否涉及炎症相关基因蛋白的表达的验证,是通过检测AngⅡ激下(10-6-10-10mol/L)两个炎症相关蛋白TNF-a及c-fos的表达来进行。研究结果：AngⅡ(10-9mol/L)的促进平滑肌标志基因SMA和calponin表达的作用可以被AngⅡⅠ型受体阻断剂losartan(?)所阻断,而非AngⅡⅡ型受体阻断剂PD123319。AngⅡ浓度依赖性的促进磷酸化Akt的表达,在AngⅡ10-9mol/L(P0.01)刺激下达最高峰。PI3K抑制剂LY294002可以阻断Ang Ⅱ刺激的平滑肌标志基因的上调,同时也可以阻断磷酸化AKt的表达,但是两组阻断剂效果不尽相同,AngⅡ刺激组较之对照组仍然有相对高表达的平滑肌标志基因及磷酸化Akt达水平。此外AngⅡ可以在适当浓度(10-8-10-9mol/L)刺激平滑肌标志基因SMA启动子的转录活性,同时可以浓度依赖性的刺激-κB p50的表达,最高刺激浓度为10-9mol/L(p0.01),而NF-κB抑制剂BAY11-7082则可抑制AngⅡ(10-9mol/L)的促进平滑肌标志基因SMA和calponin(?)琵达的作用(p0.01)。PI3K抑制剂LY294002可以阻断NF-κB p50的高表达,但是AngⅡ刺激组(10-9mol/L)较之对照组仍显示出相对高的表达活性。不同浓度的AngⅡ的刺激并未显著上调炎症相关因子TNF-a及-fos的表达。结论：AngⅡ主要通过AT1受体参与促进胚胎干细胞分化成为血管平滑肌细胞的过程。AngⅡ虽然主要是通过PI3K/Akt信号通路发挥作用,但是仍然有其他相关机制的参与。AngⅡ还可以直接在转录水平刺激胚胎干细胞的分化,转录因子子NF-κBp50与AngⅡ刺激干细胞向平滑肌细胞分化的关系非常密切,其发挥作用可以部分通过PI3K/Akt信号通路。上述的AngⅡ的促进胚胎干细胞分化成为血管平滑肌细胞的作用未涉及炎症相关基因蛋白的共同作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

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