弓形虫ME49株速殖子cDNA表达文库的构建与免疫学筛选

发布时间：2019-10-28 23:51

【摘要】：刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是专性细胞内寄生虫，属原生动物门，孢子虫纲。它能够感染多种家禽及野生生物，包括鸟类及人类；由其引起的弓形虫病（Toxoplasmosis）是一种呈全球性分布的重要的人兽共患病。人群普遍容易感染弓形虫。人可以通过摄食生的或未被煮熟的含有包囊的肉而感染，或接触被猫或其他被感染的猫科动物排泄物中包囊污染的土壤、食物或水而感染。大多数免疫功能正常的人感染弓形虫后呈隐性感染，无明显症状。女性在怀孕前感染弓形虫通常不会将感染传给胎儿；然而如果孕期(妊娠3-5周)感染弓形虫，弓形虫就会通过胎盘屏障传播给胎儿，引起流产、早产、死胎及先天性弓形虫病。先天性弓形虫病在胎儿和婴儿中可引起脑积水、脉络膜视网膜炎、肝脾肿大、血小板减少症、小头畸形等，严重者引起死亡。弓形虫病的诊断方法有直接镜检、病原学检查、动物接种、卵囊分离、免疫学检测、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验等。本实验通过利用弓形虫速殖子提取的总RNA进行弓形虫表达文库的构建，并用慢性感染弓形虫的大鼠血清对构建好的弓形虫文库进行免疫学筛选，以便获得高反应原性的抗原基因，为下一步制备高反应性的重组蛋白用于弓形虫病的诊断奠定基础。方法：本实验通过培育幼鼠肾细胞（BHK）来进行弓形虫ME49株速殖子的体外培养与传代，纯化出弓形虫速殖子，利用Trizol Reagent提取出弓形虫总RNA，以总RNA为模板，在反转录酶的作用下分别反转录出cDNA的第一链及第二链，以及一系列的蛋白酶K处理，sfi酶切，用CHROMA SPIN H-1000进行过柱分离，与λTriple×2载体相连，最终经过体外包装形成cDNA初始文库；对初始文库进行滴度检测，文库扩增，最后进行筛库.用弓形虫感染大鼠6周后取其血清筛选表达性文库。将筛选出的阳性斑挑出，置于1ml SM buffer中。继续进行二次筛选，将筛选出的阳性斑置于1ml SM buffer中。将两次筛选出的阳性斑进行PCR扩增，然后将片段与PMD-18T连接后测序。结果：原始cDNA文库容量为4×10~7pfu，扩增后的滴度为4.2×10~9pfu/ml，文库的重组率大于95%，初筛后共筛出阳性克隆40个，复筛后持续阳性的克隆共有26个，通过测序结果表明共筛到2个cDNA分子，分别编码弓形虫ME49株ROP8蛋白和CELF蛋白。结论：成功构建弓形虫ME49株cDNA表达文库，采用人工感染的大鼠血清对文库进行筛选，通过测序分析获得2个cDNA分子，分别编码弓形虫ME49株ROP8蛋白和CELF蛋白，这两种蛋白有望成为弓形虫感染的新的诊断抗原。
【图文】：

条图,弓形虫速殖子,双链,文库

② 文库中加入文库体积 7%的 DMSO，-80℃保存。1.3 结果1. 总 RNA 提取及纯度鉴定： Trizol Reagent 获得速殖子提取的 RNA 分别4ul，6ul，8ul 经 1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察到清晰的 28 s 和 18 s rRNA 条图 1.1。混合后的总 RNA 测定其 OD260/280=1.91。结果表明，，提取的 RNA合提取要求。2.弓形虫速殖子 ME49 株双链 cDNA 的合成合成的双链 cDNA 取 5ul 进行 1%琼脂糖凝胶电泳显示：cDNA 平均大小为 1-右，表明符合 cDNA 合成规律，见图 1.2.M 1 M

电泳图谱,双链,文库,提取要求

② 文库中加入文库体积 7%的 DMSO，-80℃保存。1.3 结果1. 总 RNA 提取及纯度鉴定： Trizol Reagent 获得速殖子提取的 RNA 分别4ul，6ul，8ul 经 1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察到清晰的 28 s 和 18 s rRNA 条图 1.1。混合后的总 RNA 测定其 OD260/280=1.91。结果表明，提取的 RNA合提取要求。2.弓形虫速殖子 ME49 株双链 cDNA 的合成合成的双链 cDNA 取 5ul 进行 1%琼脂糖凝胶电泳显示：cDNA 平均大小为 1-右，表明符合 cDNA 合成规律，见图 1.2.M 1 M
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

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