小鼠核移植胚胎中rDNA活性和核仁变化的研究

发布时间：2019-11-02 07:54

【摘要】：目的研究供体细胞的rDNA状态对核移植（NT）胚胎内rDNA活性以及rRNA合成和加工的影响。方法通过建立了B6D2F1品系小鼠的胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）、颗粒细胞（cumulus cells, CCs）和胎儿成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs）细胞株，检测了这三者在活性NORs数目、rDNA甲基化水平和核仁相关基因表达水平上的差异；之后以这三种细胞为供体细胞，用一步法核移植技术构建了相应的核移植（nuclear transfer, NT）胚胎，同时以单精注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）胚胎作为对照，考察了4种胚胎在原核形成、核仁蛋白分布、活性NORs数目、rDNA甲基化水平以及核仁相关基因表达等方面的差异。结果1)小鼠ICSI胚胎和NT胚胎在精子注射/激活后5h（hours post activation, hpa）开始出现核仁前体（nucleolar precursorbodies, NPBs），NPBs数目逐渐减少，直至8hpa时趋于稳定并一直持续到原核融合（16-17hpa）；2)干细胞核移植（embryonic stem cell nuclear transfer, ESNT）胚胎原核期仅有一个类原核，平均内含7.20个NPBs；颗粒细胞（cumulus cellnuclear transfer, CCNT）、成纤维细胞核移植（mouse embryonic fibroblast nucleartransfer, MEFNT）胚胎、ICSI胚胎和孤雌（parthenogenetic activation, PA）胚胎在原核期都形成2个原核/类原核，平均每个原核/类原核内分别含3.71、4.27、1.58和1.59个NPBs；3)晚2细胞期的ICSI、ESNT和CCNT胚胎在核仁周围开始出现网状结构。到4细胞期时，ICSI和ESNT胚胎的核仁呈现完全的网状结构，而CCNT胚胎核仁的网状结构仍只出现在周边区域；4)0.8μg/ml放线菌素D（actinomycin D,AD）处理颗粒细胞1h能使其失去rRNA转录和加工活性。以AD处理后的颗粒细胞作为供体构建的NT胚胎，其植入前发育能力和未处理组并无显著差异；5) ESCs有最多的活性核仁组织区（nucleolar organizingregions， NORs）数目（7.66）和最低的rDNA甲基化水平（6.76%），而且其UBF(upstream binding factor，上游结合因子)、 FBL(fibrillarin)和B23(nucleophosmin，核仁素)的表达水平显著高于CCs和MEFs；MEFs含最少的活性NORs数目（4.70）和最高的rDNA甲基化水平（22.57%）；CCs的数据居于两者之间（6.45和13.59%）；6)4细胞期时，ESNT胚胎含有与ICSI相当的活性NORs数（7.19vs.7.44），显著高于CCNT（6.68）和MEFNT胚胎（5.77）。MEFNT胚胎的rDNA甲基化水平显著高于其他3组胚胎（15.52%vs.9.39%/ICSIvs.6.36%/ESNT vs.9.67%/CCNT）。7) CCs和MEFs的核进入卵母细胞后，，B23和UBF信号在20min后消失；而ESCs的核内B23/UBF信号在1h仍能检测到；8) MEFNT胚胎的植入前发育能力低于ICSI、ESNT和CCNT胚胎；桑葚胚期其FBL和18S rRNA的表达显著低于另外三组胚胎，UBF和47S rRNA的表达显著低于ICSI胚胎。结论本实验阐明了供体细胞本身和核移植胚胎内核仁蛋白的分布情况和变化；揭示了不同分化程度的供体细胞在rDNA的活性上存在一定差异，并且这种差异很大程度决定了不同核移植胚胎中的rDNA活性的差别，进而影响核移植胚胎植入前的发育能力。
【图文】：

图 3 “两步法”和“一步法”核移植操作过程Fig.3 Manipulation procedures of “2-step” and “one-step” nuclear transfer technique1) 将卵母细胞取出，10-20 枚一批放入含 5μg/ml CB 的 HEPES-CZB 操；

在体视显微镜下观察，如表面有玻璃碎片必须除去(图 4 C)。3.6.4 超薄切片和电镜观察将回收来的样品柱顶面修成边长约1.5 mm的矩形(图4 D)，之后进行超薄切片，醋酸铀染色并干燥后，透射电镜下观察并获取图像。图 4 目标半薄切片的重包埋和回收A，光学显微镜下的半薄切片；B，对目标半薄切片进行重包埋；C，倒置显微镜观察回收的半薄切片；D，用于超薄切片的样品柱Fig.4 Re-embed and recycle of target semi-thin sectionsA: semi-thin section under light microscope; B: re-embed of targetsemi-thin sections; C: recycled semi-thin section under reversemicroscope; D: sample before conduct untra-thin section.3.7 放线菌素 D 处理颗粒细胞用于免疫荧光实验的颗粒细胞培养于腔室玻片中，待细胞贴壁生长后，往不同的孔中分别加入放线菌素 D（actinomycin D
【学位授予单位】：哈尔滨医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329.2

【共引文献】

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本文编号：2554374