miR-181a调控MSC影响PE发病机制的研究

发布时间：2019-11-03 15:59

【摘要】：本研究首先基于传统的细胞贴壁分离法和组织块贴壁分离法技术,发明了一种半贴壁的分离技术,成功有效快速地获得了大量的脐带间充质干细胞(MSC),并发现获取的脐带MSC具有通过IDO分子介导抑制T细胞的功能：其次,构建了Thl细胞诱导的小鼠子痫前期(PE)模型,发现MSC移植能降低PE模型鼠蜕膜和脾脏淋巴细胞中TNF-α及脾脏淋巴细胞中IFN-γ和IL-4的表达水平,并首次报道MSC移植能有效的缓解孕鼠的PE症状；再次,发现miR-181a在PE患者脐带和蜕膜来源的MSC中高表达,并且首次证明了miR-181a可通过TGF-β通路影响MSC细胞的增殖,高表达miR-181a的MSC可明显上调IL-6和IDO表达水平,且IL-6和IDO的高表达与miR-181a诱导JNK和p38的磷酸化有关；最后,发现高表达miR-181a的MSC可促进T细胞的增殖和IFN-γ分泌；miR-181a可降低MSC实验性结肠炎的保护作用,提示miR-181a对MSC免疫调节功能的抑制可能是PE发病的一种新见解。 1、脐带MSC分离技术的完善及其调控T细胞的机制间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)具有免疫调节功能,该细胞易于分离、培养、扩增和纯化,多次传代扩增后仍具有干细胞特性,且具有强大的增殖能力、多向分化潜能及免疫原性低等特性,被认为是具有免疫豁免能力的一群细胞。在受到炎症信号刺激的情况下,MSC会募集到发生炎症损伤的部位,通过分泌细胞因子,趋化因子和细胞外基质蛋白质,降低局部炎症损伤,参与到局部炎症部位的修复和再生。MSC能参与对多种免疫细胞的调节,抑制T、B、DC和NK细胞的增殖和细胞因子分泌。Friedenstein等人最早根据骨髓来源的成纤维样细胞和造血干细胞系对细胞培养皿塑料底部的贴附性差异,于1976年首次从兔骨髓中成功分离了MSC。除了骨髓以外,母胎界面也是一个重要的MSC细胞的来源,目前已经能从脐带、胎盘和羊膜等多种母胎界面的组织中分离到MSC。但是,有报道表明MSC的分离方法是决定MSC功能的一个重要的因素。由于MSC在组织中是少数细胞,因此采用传统的细胞贴壁分离法并不能稳定的分离到MSC。除此之外,目前已知的从组织中分离MSC的方法都必须先将组织消化成单细胞悬液,而我们选取的MSC分离来源脐带又很难用传统的胶原酶消化,再者使用长时间的消化,又可能影响细胞的活性,造成了从脐带中获得MSC比较困难。因此,寻找更好的脐带MSC分离方法势在必行。我们尝试结合传统的细胞贴壁分离法和组织块贴壁分离法,使用一种半贴壁的分离方式,成功有效快速的获得大量的脐带MSC。脐带组织块通过消化,能释放出一部分MSC细胞,同时适量的温和消化组织块,可以使其更容易贴壁。贴壁后的组织块中的MSC细胞会移动到细胞培养瓶中,并扩增。此外我们也改进了消化酶的配方,加入透明质酸酶和中性蛋白酶,可以使消化出的细胞更容易分散成单个细胞,而不会成团,更有利于脐带MSC的分离。使用我们的分离方法,24小时内可以观察到贴壁的成纤维样的细胞形态,贴壁细胞一周内分裂增殖并成漩涡状生长。为了检测分离的MSC的增殖潜能,我们检测了细胞在2周内的生长曲线,并且检测了培养后第三代MSC的表型。脐带MSC高表达CD29,CD44,CD90,CD105(SH2),CD73(SH3)和HLA-ABC,但是不表达CD19,CD11b,CD14,CD34和CD31(上皮细胞标志)和HLA-DR,和报道的骨髓MSC具有一样的表面标记表型。为了验证我们获取的脐带MSC也具有免疫抑制的功能。我们使用MSC细胞与T细胞进行共培养试验,检测MSC对T细胞增殖的影响。我们预先在PBMC中纯化获得T淋巴细胞,并用植物血细胞凝集素(PHA)预刺激,然后与MSC细胞进行共培养。72小时以后,收获T细胞,并用[3H]检测T细胞的增殖情况。结果表明,经过72小时的共培养,脐带MSC细胞可以有效的抑制PHA引起的T细胞增殖。接着,我们又进一步研究了脐带MSC是否可以影响T细胞的活化。我们收集了与脐带MSC共培养24小时后的T细胞,并用流式细胞仪检测表面标记CD25,CD69以及内源性的IFN-γ的表达情况。结果表明,脐带MSC可以有效的降低T细胞内源性的IFN-γ的表达水平,并略微的下调表面活化标志CD25和CD69的表达水平。进一步说明了脐带MSC对T细胞的免疫抑制的功能。进一步为了研究脐带MSC是如何影响T细胞的免疫功能,我们检测了脐带MSC分泌的免疫调节相关的细胞因子IL-6、TGFB、 IDO、VEGF和COX-2的mRNA和蛋白的表达水平。通过QPCR的方法验证了在脐带MSC中均表达上述细胞因子的mRNA,并通过ELISA和western blot的方法验证了在脐带MSC中大量的表达VEGF、IL6和COX-2的蛋白,而较少的表达TGF-β。此外,在正常的脐带MSC中,IDO的蛋白本底表达水平极低,几乎检测不到,而在使用IFN-γ刺激的情况下,则可以检测到大量的IDO被诱导表达。为了验证是哪种细胞因子在MSC中起到了免疫抑制的功能,IL-6和TGF-β的中和抗体,IDO的抑制剂1-M-Trp以及PGE2的抑制剂indomethacin被加入了T/MSC共培养体系中。我们的结果显示IDO的抑制剂1-M-Trp能有效的阻断MSC细胞抑制T细胞增殖的能力,而IL-6和TGF-β的中和抗体,以及PGE2的抑制剂indomethacin并不能阻断MSC细胞抑制T细胞增殖的能力。说明IDO而不是IL-6、TGF-p或者PGE2介导了脐带MSC对T细胞的抑制功能。 2、MSC移植能调控母胎界面的功能缓解子痫前期的症状为了研究MSC在母胎界面的功能,我们选择了子痫前期(Preeclampsia,PE)作为我们研究MSC的疾病模型。PE是妊娠最常见的并发症之一,发病率约占孕产妇总数的7-9%。以妊娠20周后血压增高、蛋白尿为特征,可引起孕产妇心、脑、肝、肾、肺等重要脏器功能严重受损,围生儿宫内缺氧、生长受限、胎死宫内。据临床调查资料表明,PE位居我国孕产妇死亡原因的第二。可是,PE的发病机制至今未被阐明,故目前临床上尚缺乏有效的治疗手段,很多情况下不得不提前终止妊娠,造成妊娠失败。因此,迫切需要深入研究PE的发病机制,寻找新的有效防治方法。最近的研究认为,PE可能是一种妊娠诱导的免疫性疾病,而母胎界面免疫系统平衡失调在PE的发生与发展过程中起着重要作用。在正常的妊娠过程中,体内产生的细胞因子会向Th2型的免疫状态偏移,正常妊娠孕妇的PBMC会产生更多的IL-4和IL-10,而不是IL-2和TNF-α。因此,正常的妊娠被认为是一种Th2型的免疫状态。但是与正常妊娠明显不同的是,PE患者的PBMC却产生更多的Thl型的细胞因子,并且产生Th2型细胞因子的能力也在下降,提示PE患者中的免疫状态向Thl型偏移。我们前期的结果也表面,不但在PBMC中,在蜕膜组织中,也存在Tc2和Th2细胞百分比下降,并且Tcl/Tc2细胞比例升高的情况,进一步说明了在母胎界面处也存在免疫状态向Thl型偏移的情况。其中,TNF-α这个重要的Thl型细胞因子被发现在PE患者中表达明显上升,并且可能对PE的发病起着重要的作用。PE患者中自身抗体介导的血管紧缩素受体活化被认为是通过TNF-α起作用,并且PE患者产生的血管紧缩素受体的自身抗体和TNF-α能共同影响可溶性的人血管内皮生长因子受体1和可溶性的内皮因子的表达水平。而可溶性的人血管内皮生长因子受体1和可溶性的内皮因子在PE的发病中起到了关键的作用。虽然已经有一些研究报道通过靶向特定的PE病原分子对PE进行治疗,但是目前还没有通过改善PE中的免疫失衡状况来治疗PE的报道,因此恢复PE患者体内的免疫平衡,很可能是治疗PE的新思路和手段。我们根据文献报道构建了Thl细胞诱导的小鼠PE模型,并且试图通过靶向TNF-a分子寻找治疗PE的新途径。我们之前获取了脐带MSC细胞,并证明了MSC对T细胞的免疫抑制能力。之前的报道也表明,MSC细胞可以治疗多种自身免疫疾病模型,说明MSC治疗可能是用于治疗的PE的有效候选方法。我们构建了Thl细胞诱导的小鼠PE模型,通过给PE模型鼠传输MSC的方法治疗PE。我们的结果表明,给PE模型鼠传输MSC能有效的延缓小鼠PE的发病,降低血压,减少蛋白尿并减少胎盘吸收的发生。此外,传输MSC还能保护PE模型鼠胎鼠的生长发育,提高胎盘胎仔重和活胎数量。对肾脏和胎盘的组织学分析也表明传输MSC能减弱肾脏和胎盘部位的病理情况。更重要的是,给PE模型鼠传输MSC能降低蜕膜和脾脏淋巴细胞中TNF-α的表达水平,同时也能降低IFN-γ和IL-4在脾脏淋巴细胞中表达水平。这说明MSC可以通过逆转PE模型鼠蜕膜和脾脏淋巴细胞中细胞因子的异常表达来保护妊娠。我们首次报道了通过给PE模型鼠传输脐带MSC能有效的缓解孕鼠的PE症状。给PE模型鼠传输脐带MSC能降低PE模型鼠血压,减少蛋白尿并减少胎盘吸收的发生,减轻PE引起的肾小球肾炎,保护胎鼠发育过程。并且,我们阐述了MSC可能是通过反转了TNF-α在蜕膜和脾脏淋巴细胞中的异常表达达到缓解孕鼠的PE症状的机制。同时MSC能有效的缓解孕鼠的PE症状,也从侧面说明在PE患者母胎界面,MSC可能发生了功能异常。提示MSC的改变可能是PE发病的一个新的机制。 3、 miR-181a调控MSC的机制母胎界面的MSC是怎样发生变化的呢?microRNAs (miRNAs)的发现是近年重大的科学突破之一,改变了我们寻找基因调节的方法。microRNAs是一种短(19-25核苷酸)的单链非编码RNA,他通过和mRNA3'端非翻译区结合调节目的基因的表达水平。miRNAs的高表达或下调以及遗传改变可影响它们与靶基因的结合,涉及许多疾病的发病机制,并涉及发育、分化、凋亡及肿瘤形成等多种生物学功能。我们前期研究发现PE患者胎盘中miR-181a水平表达升高,提示我们miR-181a可能通过影响MSC的功能从而影响PE的疾病发生。miR-181a据报道有抑制肿瘤细胞的生长,并调节免疫细胞的功能,但是miR-181a在MSC中的具体功能还未见报道。为此,我们研究了miR-181a是否能够调控MSC细胞的生长并且改变MSC的免疫调节功能,同时miR-181a对MSC的调控作用是通过什么信号通路介导的。我们发现,在PE患者脐带和蜕膜来源的MSC中,miR-181a的表达水平要高于正常妊娠来源的MSC。说明在PE患者中MSC细胞可能发生了改变。我们将分别用于高低表达miR-181a的片段pre-miRNA181a分子以及anti-miR-181a inhibitor利用Lipofectamine2000转入MSC细胞,并利用CCK8和流式细胞术检测转染后的细胞的增殖情况和细胞活力。结果表明,在MSC细胞中高表达miR-181a,会影响MSC细胞的增殖,但是不会影响MSC细胞的凋亡。为了研究miR-181a影响细胞的增殖的机制,我们使用计算机预测miR-181a相关的靶基因,并发现miR-181a靶向TGF-β通路蛋白TGFBR1和TGFBRAP1。我们采用QPCR检测了高表达miR-181a的MSC中TGFBR1和TGFBRAP1分子mRNA表达水平,并采用Westernblot检测TGFBR1和TGFBRAP1分子蛋白表达水平,并构建了含有TGFBR1和TGFBRAP13'UTR的luciferase质粒验证miR-181a是否与TGFBR1和TGFBRAP1的3’UTR直接结合。结果表明,高表达miR-181a降低了MSC中TGFBR1和TGFBRAP1分子mRNA和蛋白的表达水平；luciferase荧光报告基因实验也证实miR-181a直接结合TGFBR1和TGFBRAP1的3’UTR；此外,高表达miR-181a的MSC细胞SMAD2磷酸化水平明显低于对照组。说明miR-181a是一个内源性的TGF-β通路阻断剂,miR-181a可通过TGF-β通路影响MSC细胞的增殖。另一方面,MSC的免疫调节功能也是MSC的一个重要功能,将分别用于高低表达miR-181a的片段pre-miRNA181a分子以及anti-miR-181a inhibitor利用Lipofectamine2000转入MSC细胞,并利用QPCR检测了与MSC的免疫调节功能相关了细胞因子(IL6, TGFB, IDO, VEGF和COX2)的表达水平。结果显示,高表达miR-181a明显上调IL6和IDO mRNA表达水平。通过ELISA和Western blot检测也验证了上述的结果。为了研究miR-181a诱导IL6和IDO高表达的机制,我们使用MAPK通路的抑制剂处理高表达miR-181a的MSC细胞,结果表明JNK的抑制剂抑制了miR-181a诱导的IDO表达,而p38的抑制剂抑制了miR-181a诱导的IL6表达。说明miR-181a可能通过诱导JNK和p38的磷酸化水平诱导IL6和IDO高表达。我们还检测了高表达miR-181a的MAPK通路的磷酸化水平。结果显示,miR-181a在转染MSC细胞18小时后上调了JNK和p38激酶的磷酸化水平。为了研究miR-181a对MSC细胞因子分泌水平的影响是否会影响MSC对免疫细胞的调节功能,我们将高表达miR-181a的MSC的细胞和T细胞共培养,结果显示,在短期培养的情况下,高表达miR-181a的MSC甚至会促进T细胞的增殖,而不是像正常MSC一样抑制T细胞的增殖；并且高表达miR-181a减弱了MSC抑制T细胞表达IFN-y的能力。我们的结果证明了miR-181a在MSC细胞中生长和免疫调节功能的双向调节作用。为了进一步验证miR-181a对MSC功能的影响,我们研究了miR-181a对MSC传输治疗的作用。MSC已经被用于治疗移植物抗宿主病,糖尿病,类风湿关节炎,自身免疫性脑脊髓炎,系统性红斑狼疮,牙周炎,炎症性肠道疾病和败血症等多种动物疾病模型,并证实了其在体内免疫抑制和抗炎症的作用。虽然我们之前的研究表明通过给PE模型鼠传输脐带MSC能有效的缓解孕鼠的PE症状。但是Thl诱导的PE模型有其本身的局限性,虽然该模型具有PE的一些特征,但并不能完全的反应人类PE的全部症状和病理情况,因此未被广泛应用。 DSS诱导的实验性结肠炎是一个广泛使用的研究免疫炎症状态的模型,MSC用于治疗DSS诱导的实验性结肠炎模型的报道已有多篇,是一个比较成熟的用于研究MSC治疗的模型。我们通过连续给雄性C57BL/6小鼠口服3%DSS8天,成功诱导了结肠炎模型。相对于正常组的小鼠,模型组小鼠有更高的疾病评分,并伴随着体重下降,更短更轻的结肠,以及更高的死亡率。组织学的研究也表明,模型组小鼠发生肠壁增生并有局部炎性细胞浸润,伴随着上皮溃疡和杯状细胞丢失。而传输正常的MSC细胞可以有效的减缓疾病的发生程度,表现在更低的疾病评分,稳定小鼠体重,抑制结肠炎症的发生。在DSS诱导后第12天可以观察到更长更重的结肠以及更低的死亡率。组织学的结果也表明,MSC传输可以阻止肠壁增生和局部炎性细胞浸润,恢复上皮溃疡和杯状细胞。更重要的是,miR-181a会降低MSC对DSS诱导的实验性结肠炎的保护作用。显示了miR-181a在体内降低了MSC的免疫调节功能。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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