HCV多CTL表位树突状细胞疫苗的构建及体外刺激T细胞反应

发布时间：2019-11-04 12:03

【摘要】：丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）是引起慢性肝脏疾病的主要原因之一，全世界约有1.7亿HCV感染者，丙肝感染已成为全球性的、严重的公共卫生问题之一。HCV感染后，约50%～85%发展为慢性肝病，甚至肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌。目前，聚乙二醇干扰素-α和利巴韦林联合应用是丙型肝炎治疗的标准方案，其持续应答率只有50%，且副作用大，费用昂贵，停止治疗后仍有很高的复发率。目前还没有有效的抗HCV疫苗，所以研制预防性和治疗性抗HCV疫苗很重要。 以抗原表位预测和人工合成抗原表位基因为基础的多表位DNA疫苗是新型疫苗研究热点。表位又称抗原决定簇，是指免疫细胞能识别的抗原分子上的一个特定部位，可以和病毒的受体结合。重组多表位疫苗是指同时携带多个目标抗原相关表位以及辅助性表位的疫苗，它能有效地应付病原微生物的变异，克服主要组织相容性复合体(MHC)分子的遗传限制，为特异性免疫治疗和基因治疗奠定了基础。要获得具有较强免疫原性的HCV多肽，广泛地激发机体的CD8+T细胞介导的免疫反应，必须具有HCV不同区段的多个表位。我们利用生物信息学方法，用计算机预测出12条多肽，分别用每条肽体外刺激外周血单个核细胞，观察其增殖情况，ELISA方法检测培养上清中IFN-γ水平的变化。结果显示预测的HCV CTL表位NS4B(1793-1801)和P7（774-782）在体外能够刺激T细胞反应。 树突状细胞是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，是启动、调控并维持免疫应答的中心环节，其最大特点在于能够激活初始型T细胞，启动获得性免疫，故是机体免疫应答的始动者，在免疫反应中起到举足轻重的作用。目前，基因转导DC制成的DC疫苗已成为研究的热点。利用腺病毒载体介导基因转移，以其高效和良好的靶向性成为基因治疗中常用的方法。 我们在此研究基础上构建含能表达这两个HCV多CTL表位的DC疫苗，体外观察其促进T细胞的反应和细胞毒杀伤效应，为抗HCV的DC疫苗研制打下基础。 1．DC的体外培养和鉴定 全血来自于健康供者，经Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），按CD14MicroBeads humanmonocyte kit(MACS)操作说明，分离收集CD14+单核细胞。用无血清培养液X-VIVO15调整CD14~+单核细胞密度为1×10~6cells/mL接种于24孔板，并加入GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)5%C02，37℃孵育培养5天，隔日半量换液，，第5天起加入成熟诱导因子TNF-α（10ng/mL）、IL-1β（10ng/mL）、IL-6（10ng/mL）、PGE2（1μg/mL）培养2天，即可诱导出成熟的树突状细胞。显微镜和流式细胞仪观察和鉴定DC成熟状态。 2．负载HCV多表位的腺病毒刺激DC 重组腺病毒表达质粒AD1（多HCV表位）、AD2(阳性对照)和AD3（阴性对照）以50至1000感染复数（MOI）感染DC，于感染后48h荧光镜下观察细胞GFP的表达，应用流式细胞术（FCM）测定腺病毒介导基因转染DC的效率。PCR和Western blot检测DC细胞内重组HCV多表位抗原基因序列的存在和表达。 3．DC体外刺激T细胞 收集感染重组腺病毒和未感染重组腺病毒的DC作为刺激细胞，取CD14-PBMC为效应细胞，进行混合淋巴细胞培养。ELISA检测DC上清IL-12p70和混合淋巴细胞培养上清IFN-γ。用LDH释放法检测CTL活性。 结果： 1．DC呈半悬浮生长，胞体不规则增大，胞膜向外伸出呈树枝样突起。用流式细胞仪检测不成熟DC、成熟DC和腺病毒感染DC的表面标志CD83、CD86、CD80和HLA-DR，结果显示成熟DC和腺病毒感染DC比不成熟DC的表面标志表达明显升高。 2．重组腺病毒有效感染DC，荧光镜下细胞有GFP的表达。用特异性引物对重组腺病毒感染24h后DC的总RNA进行PCR，，结果显示在150bp处有特异性扩增条带，其大小与目的基因大小相符。用鼠抗FLAG抗体为一抗， HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，对重组腺病毒感染48h后DC的总蛋白进行Western blot分析，结果可见大小约为10KD的蛋白，这与预计的序列1-FLAG和序列2-FLAG融合蛋白大小一致，表明DC成功表达出序列1和序列2蛋白。 3．DC能刺激T细胞增殖，腺病毒感染DC分泌IL-12p70增多，其刺激T细胞分泌IFN-γ增多。重组多CTL表位腺病毒感染的DC可诱导特异性的细胞免疫应答。 综上所述，重组多CTL表位腺病毒在体外能有效感染DC，促进T细胞反应，为下一步抗HCV的DC疫苗研制打下基础。
【图文】：

一、HCV 感染的后免疫应答HCV 基因组有 9.6kb，编码 3010aa 的多肽，由结构蛋白（Core、E1 和E2）和 7 个非结构蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B）组成[1](图 1)。

在持续 HCV 基因组复制过程中，尽管有强烈的 CD8+T 细胞反应，许多 T 细胞表位是完整的且不发生变异[4]。这些观察表明，突变逃避不是逃避抗原特异性 T 细胞的唯一机制。表明有多个互补的途径如功能性无能和调节性 T 细胞群的生成，导致病毒持久维持[5]（图 2）。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392


本文编号：2555620