白色念珠菌诱导活化的巨噬细胞中半乳糖凝集素-3的表达及作用

发布时间：2019-11-07 13:36

【摘要】：第一部分白色念珠菌对巨噬细胞U937的活化作用实验目的：观察白色念珠菌对人巨噬细胞系U937细胞的活化作用。方法：观察不同浓度不同作用时间点的白色念珠菌刺激人巨噬细胞系U937细胞后细胞培养液中NO浓度和Galectin-3的表达以及对细胞存活率的影响。结果：1、白色念珠菌终浓度与巨噬细胞系U937细胞存活率与因子表达：在107PFU/mL及以下时,,促进细胞生长,相对存活率升高,细胞中NO及Galectin-3的表达增强,各组间比较有统计学意义(P0.05)；在108PFU/mL及以上时,可抑制细胞生长,相对存活率降低,细胞中NO及Galectin-3的表达降低,各组间比较有统计学意义(P0.05) 2、白色念珠菌作用时间与巨噬细胞系U937细胞存活率与因子表达：白色念珠菌处理3h及以上时,可促进细胞生长,细胞中NO及Galectin-3的表达增强,各组间比较有统计学意义(P0.05)；白色念珠菌处理3h及以下时,对细胞生长影响不大,细胞中NO及Galectin-3的表达变化不明显,组别之间差异无统计学意义(P0.05)。结论：1、白色念珠菌浓度在107PFU/mL及以下时,刺激人巨噬细胞系U937细胞活化。对NO浓度和Galectin-3的表达以及对细胞存活率的影响呈正相关。 2、白色念珠菌作用时间3h及以上时人巨噬细胞系U937细胞活化。第二部分半乳糖凝集素-3在白色念珠菌诱导的人巨噬细胞系U937细胞中的表达及其功能目的：观察Galectin-3在白色念珠菌诱导的人巨噬细胞系U937细胞中的表达并探讨其功能。研究方法：通过慢病毒载体介导的Galectin-3-shRNA沉默基因,建立半乳糖凝集素-3基因阻断的人U937巨噬细胞株模型,体外评价和观察galectin-3在人巨噬细胞系U937细胞受白色念珠菌感染时的细胞存活率的影响以及细胞培养液中NO浓度、IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表达的变化,Galectin-3与白色念珠菌的结合测定,激光共聚焦显微镜观察Galectin-3与TLR2、TLR4的表达分布。结果：1、利用通用引物对菌落进行PCR检测。获得阳性克隆4个,送3号样品进行测序验证。测序结果表明,针对galectin-3的shRNA序列已经成功连入慢病毒载体。 2、定量PCR和Westernblot检测表明细胞内的Galectin-3表达受到显著的敲减。 3、白色念珠菌刺激U937后,可促进细胞生长,细胞中IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表达增强,NO水平呈上升,组别之间有统计学意义。沉默Galectin-3后细胞生长受到抑制,细胞相对存活率下降,细胞中IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表达增强,NO水平呈上升,组别之间有统计学意义。 4、结合测定结果随着白色念珠菌浓度的升高,Galectin-3与白色念珠菌的结合程度相应加深,当浓度在107PFU/mL及以上时有明显上调,组别之间有统计学意义,当浓度在109PFU/mL时,与108PFU/mL组相比,无统计学意义。沉默Galectin-3后,得到相似结果。但是结合程度较对照组明显下降。结论： 1、本实验成功构建了慢病毒载体介导的Galectin-3-shRNA沉默基因人U937巨噬细胞株模型。 2、Galectin-3对白色念珠菌刺激人巨噬细胞系U937细胞后细胞培养液中NO浓度、IL-8、TNF-α、COX2、TLR2和TLR4表达的调节呈负相关,对细胞存活率的影响呈正相关。 3、Galectin-3能与白色念珠菌直接结合。第三部分半乳糖凝集素-3在白色念珠菌诱导的人巨噬细胞系U937细胞中的作用机制分析目的：探讨半乳糖凝集素-3在白色念珠菌诱导的人巨噬细胞系U937细胞中的作用机制。研究方法：蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞中FAS、NF-κB、JNK和ERK1/2蛋白含量。结果：1、在Galectin-3被抑制的情况下,白念珠菌感染会造成细胞中FAS和NF-κB蛋白的表达上调。 2、在Galectin-3被抑制的情况下,白念珠菌感染会造成细胞中磷酸化JNK表达上调和磷酸化ERK1/2蛋白表达下调。结论：1、在白色念珠菌诱导的人巨噬细胞系U937细胞中Galectin-3参与了MAPK通路的应答激活。 Galectin-3通过调节Fas和NF-κB的表达参与抗细胞凋亡作用。 3、Galectin-3是抑制白念珠菌感染的关键分子和潜在的治疗靶标。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R379

【参考文献】