miR-1介导Notch信号通路调控大鼠MSCs向心肌样细胞分化的研究

发布时间：2019-11-07 16:38

【摘要】：目的和意义 移植骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）治疗缺血性心肌病已成为一大热点。研究表明肌特异性miR-1在调控细胞肌分化方面起着关键作用。Notch信号通路参与调控众多细胞生命过程，包括细胞增殖、凋亡和分化。有报道Notch信号通路与miRNAs之间相互作用，miRNAs调控Notch信号通路发挥生物学作用。基于此，我们假设转导miR-1至大鼠MSCs内并调控Notch信号通路来促进MSCs分化为心肌样细胞，为缺血性心肌病的细胞治疗提供可能。 方法 采用全骨髓贴壁培养法从大鼠骨髓中获得MSCs并观察细胞形态，流式细胞学鉴定MSCs；同时合成携带GFP过表达miR-1慢病毒转导系统（MSCs~(miR-1)），对照组只携带GFP；将过表达miR-1慢病毒系统转导大鼠MSCs并培养15天,光镜下观察转导后细胞形态变化；在第0、4、6、15天qRT-PCR检测miR-1、心肌相关基因GATA-4、α-actin、cTnI和Connexin43(Cx43)及Notch信号通路相关基因mRNA的表达变化；免疫荧光观察cTnI和Cx43的表达；Western blotting检测α-actin的蛋白表达。 结果 原代细胞呈长梭形、漩涡状生长，流式细胞学检测结果显示98%以上细胞表达CD44和CD29，1%以下表达CD45；与对照组相比，MSCs~(miR-1)组的miR-1的含量明显增高；转导miR-1后，MSCs~(miR-1)组高表达心肌相关基因：包括GATA-4、α-actin、cTnI和Cx43；转染4天后免疫荧光即可检测cTnI和Cx43在MSCs~(miR-1)组的一些细胞中表达，并在第15天时表达最强；Western blotting更进一步证实了α-actin在MSCs~(miR-1)组中的表达。观察转导前后Notch信号通路基因的mRNA水平变化发现，miR-1通过调控配体Jagged1来促进分化；Jagged1的mRNA水平下调负性调控MSCs的肌细胞分化过程，同时我们观察到了Notch1、Notch3和Hey2的mRNA水平下调，这说明，miR-1促进的肌分化过程伴随着Notch信号通路的Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2mRNA水平的显著下调Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2是肌分化过程中Notch信号通路的关键因子，这也许可以用来调控干细胞命运。 结论 转导miR-1至大鼠MSCs中可促使其向心肌样细胞的分化并伴随下调Notch信号通路Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2的mRNA水平。
【图文】：

第 3 章 结果3.1 大鼠 MSCs 生长特点全骨髓贴壁培养法提取大鼠原代MSCs，显微镜下观察细胞24h便开始贴壁，细胞形态均一，，呈梭形或多角形。48h 后首次换液去除未贴壁细胞，3 到 4 天后可见放射状排列的细胞集落，伸出长短不一、粗细不均的突起，梭形细胞为主，细胞核明显，核浆比例大（图 1 左）。5 天左右细胞集落生长范围扩大，融合80-90%，经胰酶消化以 1:2 传代，传代后 8h 即可贴壁、3 天后即可 80%铺满瓶底,漩涡状明显，同向排列（图 1 右）。

3.3.1 线性化载体构建EcoR I酶切化学合成的含有目的基因的质粒，琼脂糖凝胶电泳显示在289bp位置有条带，与目的基因实际片段大小相符（图3左）。同样，使用EcoR I对载体质粒进行酶切消化，因从细菌中提取的质粒可能存在超螺旋，开环，线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，质粒经单酶切消化后，在目标位置呈现出均一的电泳条带，显示载体线性化成功（图3右）。Quadrant StatiFile: 2011-7-7.002 Log Data Units: Linear ValueSample ID: Patient ID:Tube: Panel:Acquisition Date: 07-Jul-11 Gate: G1Gated Events: 9987 Total Events: 10998X Parameter: FL1-H CD45-FITC Y Parameter: FL3-H CD29-PQuad Location: 14, 18Qua Events% Gate% Tot X Mea X Geo MeY Mea Y Geo MeUL 988 99.0 89.9 4.11 3.771046.5 898.7UR 98 0.98 0.89 62.4 26.6 1479.5 1213.6LL 2 0.02 0.02 4.41 4.20 13.6 13.4LR 0 0.00 0.00 *** *** *** ***R1Histogram StaMark Left, Rig Event % Gat % Tot MeanGeo Me CV MediaPeak CAl 1, 99 987 100.0 82.0 31.2 27.2 58.5 27.3 28M1 1
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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本文编号：2557369