牛乳中β-酪蛋白构象性表位定位研究

发布时间：2019-11-07 20:29

【摘要】：牛乳是引起食物过敏的八大类常见食物之一。据报道,牛乳过敏引发的病症在婴幼儿中尤为常见,1岁以下婴幼儿中的发生率约为2-3%。因此,开展牛乳过敏的研究对于提高牛乳过敏人群生活质量具有重要的的现实意义。另外,由于表位是食物过敏反应的物质基础,所以表位定位是牛乳过敏研究的一个核心问题,也是人们认识食物过敏的首要任务。本文以过敏原蛋白质β-酪蛋白为研究对象,从鲜牛乳中分离纯化β-酪蛋白、制备特异性多克隆抗体、亲和纯化多克隆抗体、建立β-酪蛋白构象模型、最终定位出β-酪蛋白的构象性表位,主要的研究工作和结论如下。 1.采用等电点沉淀法从鲜牛乳中得到酪蛋白,冷冻干燥后的酪蛋白粉末经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离后,得到了β-酪蛋白。经过SDS-PAGE电泳和等电聚焦电泳鉴定,结果表明,获得了纯度高于90%的β-酪蛋白。 2.采用分离纯化的β-酪蛋白免疫日本大白耳兔,制备兔抗牛乳β-酪蛋白多克隆抗体,免疫过程中利用间接ELISA方法监测免疫效价的变化,最终得到效价分别为1：240,000和1：150,000的抗血清各一份。 3.利用溴化氰活化的Sepharose4B对抗8-酪蛋白兔血清进行亲和纯化,经SDS-PAGE电泳检测,结果显示纯化后抗体在泳道中基本上只显示出重链(55Kda)和轻链(22Kda)2条带,纯化效果较好；同时对纯化后抗体进行间接ELISA效价测定,A、B两兔的血清效价分别从亲和纯化上样前的100,000和70,000上升到纯化后的120,000和80,000,表明经过亲和纯化,得到了高纯度和高特异性的多克隆抗体。 4.分别利用同源建模、折叠识别法建模、从头预测方法对β-酪蛋白结构模型进行构建,并对所建模型进行逐级开放式优化和Ramanchandran plot、WHAT_CHECK、ERRAT等方法评估,选择最优模型,结果得到经同源建模并经过优化后的模型为最终的β-酪蛋白结构模型；以文献报道的针对β-酪蛋白空间构象的实验数据作为参照,将所建模型与Kumosinski等人的p-酪蛋白典型模型进行比较,评价本研究工作中建模结果的准确性,结果显示,与Kumosinski等人所建模型相比,本实验所建模型更能与β-酪蛋白空间构象的实验数据吻合。 5.通过噬菌体肽库筛选得到了用于β-酪蛋白构象性表位定位的6个模拟肽；同时通过搜索得到晶体结构已解析的抗原抗体的复合物,并提取其中的表位信息,形成数据信息库,然后对该库进行统计分析,得到表位覆盖面积大小、表位氨基酸数目、不同种类表位氨基酸残基的出现频率、表位中起间隔作用的氨基酸残基类型和出现频率以及表位氨基酸残基在不同蛋白质二级结构中出现频率等信息；所得信息结合噬菌体肽库筛选结果,最终定位出β-酪蛋白的4个构象性表位。
【图文】：

电泳图,离子交换层析,电泳图,样品

收集图2.1中的各洗脱峰进行电泳鉴定，在SDS一PAGE电泳的结果中与蛋白质Maker的比对得到所得蛋白质的分子量，，根据条带定性得到蛋白质的纯度。粗蛋白和图2.1中a、b、c、d峰对应图2.2中的e、a、 MeabCb、c、d五条泳道。d嘉涵藏疾奔娜赢澎舔谙沪叮、泛舞辫牵_ Da9570307255嚼输秘娜痴43翩枷娜终水娜·馨鑫典:嘴耀髦澎热瘫娜渺娜一图2.2离子交换层析各峰样品SDS一队GE电泳图M低分子量蛋白marker，e:酪蛋白全蛋白;a:图2.1中峰a;b:峰b;。:峰c;d:峰d; Figure2.2SDS一 PAGEelectroPhoretiePatternsofthePeakseolleetedduringion一exehangeehromatograhPy由图可以看出，b峰和c峰所对应的SDS一PAGE条带纯度较高，分子量与p一酪蛋白相吻合，但是c峰电泳条带显示纯度比b峰略低，而且上样过程中只是收集峰顶位置进行检测，c峰与d峰没有很好的分离，因此收集图2.1和2.2中所示的纯度较高、分离纯度较好的b峰进行下一步的IEF一队GE鉴定蛋白质的等电点

等电聚焦电泳

收集峰顶位置进行检测，c峰与d峰没有很好的分离，因此收集图2.1和2.2中所示的纯度较高、分离纯度较好的b峰进行下一步的IEF一队GE鉴定蛋白质的等电点，所得图谱如图2.3所示，根据离子交换层析、SDS一队GE和等电聚焦图谱
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】