miR-145对VSMC表型转化和增殖的影响及机制探讨

发布时间：2019-11-09 13:31

【摘要】：第一部分大鼠miR-145慢病毒表达载体的构建及鉴定目的：构建针对rno-miR-145的慢病毒表达载体并鉴定其在血管平滑肌细胞（VSMC）中是否过表达。方法：人工合成含有酶切位点粘端miR-145 shDNA双链模板序列，克隆于LV3pGLV/H1/GFP+Puro-miRNA慢病毒穿梭载体中,转染293FT细胞,收获并浓缩慢病毒颗粒，同时构建无关序列阴性对照载体（Scramble-NC）。采用组织块贴壁法培养SD大鼠原代VSMC，并将细胞分为3组：正常对照组、miR-145组、miR-NC组。倒置荧光显微镜下观察VSMC感染后的荧光表达情况,Real-time PCR检测各组miR-145的表达情况。结果：（1）成功构建了miR-145慢病毒载体，测定病毒滴度为1×109TU/ml。（2）倒置荧光显微镜下观察大鼠microRNA-145慢病毒表达载体感染成功，MOI值为50，感染72h时感染率最高。（3）Real-time PCR结果显示构建的miR-145过表达慢病毒载体在感染目的细胞72小时后较空白细胞或阴性对照细胞表达丰度增加72.50倍(P0.01)。结论：（1）建立了高效稳定表达rno-miR-145的慢病毒转染系统（2）miR-145慢病毒载体感染VSMC后可高效的过表达，从而为进步研究miR-145在大鼠VSMC中的作用提供理论依据。第二部分miR-145对VSMC表型转化及增殖的影响目的：miR-145慢病毒载体感染大鼠原代VSMC,PDGF-BB诱导VSMC表型转化及增殖，选择3个VSMC表型标志基因PCNA、c-Jun及SM22a，观察miR-145对VSMC表型转化和增殖是否有抑制作用。方法：采用组织块贴壁法培养SD大鼠原代VSMC，加入PDGF（10ng/ml）诱导VSMC发生表型转化，使VSMC转化为去分化型（即获得增殖能力），，并将细胞分为4组：正常对照组、PDGF-BB（10ng/ml）组、PDGF-BB（10ng/ml）+ miR-145组及miR-NC组。CCK-8法检测各组细胞的增殖情况；实时RT-PCR方法检测miR-145过表达后对PCNA、c-Jun及SM22a mRNA水平的影响；Western印迹方法检测miR-145过表达后对VSMC表型转化标志基因蛋白水平的影响。结果：CCK-8结果显示：与空白对照组相比，miR-NC组OD值无显著差异（P＞0.05）；PDGF组OD值明显升高（P0.01）；与PDGF-BB组比较，PDGF-BB+ miR-145组OD值明显下降（P0.05）。RT-PCR结果显示：与空白对照组比较，miR-NC组PCNA、c-Jun及SM22a mRNA的表达无显著差异（P＞0.05）；PDGF组PCNA、c-JunmRNA的表达分别上调37%（P0.05）和168%（P0.01），而SM22a mRNA的表达下调80%（P0.01）；与PDGF-BB组比较，PDGF-BB+ miR-145组PCNA、c-Jun mRNA的表达分别下调66%和77%（P0.01），而SM22a mRNA的表达上调335%（P0.01）。Western-blot结果显示:与空白对照组比较，PDGF组PCNA、c-Jun mRNA的表达明显上调（P0.01），而SM22a mRNA的表达明显下调（P0.01）；与PDGF-BB组比较，PDGF-BB+ miR-145组c-Jun、PCNAmRNA的表达明显下调（P0.01），而SM22amRNA的表达明显上调（P0.01）。结论：1.miR-145可抑制PDGF诱导的VSMC增殖；2. miR-145可上调VSMC分化相关基因而下调增殖相关基因的表达，从而抑制VSMC的表型转化。第三部分miR-145通过MAPK信号转导通路抑制VSMC增殖目的：选择丝裂原活化蛋白激酶信号系统(MAPKs)家族的3个亚类：ERK1/2、JNK/SAPK、p38MAPK，探讨miR-145过表达对PDGF-BB诱导的p-ERK/ERK、p-JNK/JNK及p- p38MAPK /p38MAPK蛋白表达的影响，进步分析miR-145是否通过MAPK信号转导途径抑制VSMC增殖。方法：采用组织块贴壁法培养SD大鼠原代VSMC，加入PDGF（10ng/ml）诱导VSMC发生表型转化（即获得增殖能力），并将细胞分为4组：正常对照组、miR-NC组、PDGF-BB（10ng/ml）+ miR-145组及PDGF-BB（10ng/ml）组。Western印迹方法检测ERK1/2和p-ERK1/2的表达、JNK和p-JNK的表达以及p38MAPK和p-p38MAPK的表达。结果：Western-blot结果显示:PDGF-BB（10ng/ml）诱导VSMC后，p-ERK、p-JNK和p- p38MAPK水平明显上调，与空白对照组相比差异有统计学意义（P0.05）。转染miR-145干预72h后再加入PDGF-BB刺激，p-ERK、p-JNK和p- p38MAPK水平明显下调，与PDGF组相比差异有统计学意义（P0.05）。空质粒组与空白对照组相比无统计学意义（P＞0.05）。结论：miR-145通过抑制MAPK信号通路的磷酸化，进而抑制PDGF诱导的VSMC增殖。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】