脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化过程中MicroRNA活性变化的实验研究

发布时间：2019-11-14 09:01

【摘要】：目的: 1.探索SD大鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)的分离、培养方法； 2.证明ADMSCs在5－氮杂胞苷(5-Aza)诱导下可分化为心肌细胞； 3.探讨ADMSCs细胞在向心肌细胞分化过程中miRNA的变化谱。 方法： 1.SD大鼠ADMSCs的分离、培养、鉴定：无菌条件下取SD大鼠腹股沟皮下脂肪组织，采用胰酶加I型胶原酶消化法及贴壁法进行分离培养及形态学观察；取第3代细胞进行表面抗原的免疫细胞化学鉴定； 2.ADMSCs的体外诱导及鉴定：对第3代细胞行5-Aza诱导，观察细胞形态变化，进行α-actin及cTnT免疫细胞化学鉴定。 3.测定培养ADMSCs向心肌细胞分化过程中miRNA的变化谱：细胞分为三组，第一组为第三代ADMSCs，第二组为同期培养未经诱导的ADMSCs，第三组为经5-Aza诱导后培养四周的细胞。应用miRNA生物传感器阵列（miRNAA-SensorArray）方法分别检测以上三组细胞的miRNA谱，比较之间的差异。 结果： 1.脂肪组织中含有大量长梭形细胞，成螺旋形生长，免疫化学鉴定显示与空白对照相比较细胞表面分子抗原CD13、CD44、CD105呈阳性反应，CD34、CD45、HLA-DR和Ⅷ因子均为阴性反应。 2.10umol/L的5-Aza诱导24小时后更换含10％胎牛血清的IMDM培养基继续培养，多数细胞为长梭形，部分细胞形态变为不规则星状或杆状，细胞体积及胞核变大，部分细胞聚集成团。与空白对照比较28d后多数细胞免疫细胞化学染色显示α-actin、cTnT呈阳性反应。 3.应用miRNA生物传感器阵列（miRNAA-SensorArray）方法分别检测三组细胞123种miRNA活性，第三代ADMSCs中miRNA活性值RIF不小于5的共有35种。发现诱导后细胞的所有miRNA活性均有所上升。活性上升最为明显的15种miRNA顺序为：let-7a，let-7b，let-7e，let-7f，let-7g，miR-125a-5p，miR-142-5p，miR-143，miR-145，miR-21，miR-222，miR-34c-5p，miR-92a。 结论： 1.出生三天的SD大鼠脂肪组织中含有具有多向分化潜能的间充质干细胞。 2.10umol/L浓度的5-Aza可诱导脂肪干细胞分化为心肌样细胞。 3.miRNA生物传感器阵列方法同时大批量连续检测多种miRNA活性，利于miRNA活性谱的连续监测。 4.多种miRNA可能在细胞分化过程中起到重要作用，其中发挥最重要作用的miRNA可能是let7家族和miR-21。
【图文】：

军 医进 修学 院 硕 士学 位论 文分类 似 成 纤维 细 胞 样 ，少 数 呈 多 角形 ， 部 分有 粗 大 突 起。 细 胞 核多 居 中， 常 见 1 ～ 2个 核 仁。 4 8 h 后 ， 贴 壁 的 细胞 开始 逐 渐分 裂增 殖 ，伸 展 变大 ， 约 3 ～5 d 后 ， 多 能 80 % 左右 融 合 成单 层 细 胞 ，可 进 行 传代 培 养 。传 代 后 的 细胞 生 长 速度 明 显 快 于原 代 细 胞， 约3 ～ 4天 传 代 一次 。 经 3 ～4 次 连 续传 代 后， 细胞 多 变 为 均一 的 梭 形 ，排 列 更 加整 齐 有序 ， 部分 呈 螺旋 巢 状分 布 ， 杂质 细 胞明 显 减少 。

军 医进 修学 院 硕 士学 位论 文如 图 1 -5 所 示， 起 始 每孔 接 种细 胞 数 个数 为 2. 0 × 10 4， 第 4 代 与 第 7 代 间胞生 长 曲 线基 本 吻 合 。由 此 说 明： 不 同 代细 胞 的 生 长曲 线 可 重复 性 好 ， 细胞 可 持良 好 并 且均 一 一致 的 生 长速 度 。 （三 ） AD M S Cs 冻存 与 复苏 对 存活 率 的 影响 ： AD M S C s 冻存 4 周后 ， 3 7℃ 水 浴 快 速复 苏 ， 台 盼蓝 拒 染 法检 测 细 胞 存活 率 90 % 以 上 。 不 同传 代 细胞 冻 存和 复 苏 后， 存 活率 差 异 不大 。 （四 ） 细胞 表 面标 记 鉴定 ： 第 3 ～ 6 代 细 胞 表 面 分 子 C D1 3 、 C D4 4 、 C D1 05 均 阳 性 表 达 ，， 其 中 C D1 3 子染 色最 强 （ 图 1 -6 ～ 1- 8 ）；C D4 5 、H L A -D R 、Ⅷ 、 V W F 因子 均阴 性 。复 苏后 胞表 面 标记 物 C D1 3 、 C D4 4 、 C D1 0 5 保持 阳性 。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】

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1 张端珍,盖鲁粤,刘宏伟,朱鲜阳;脂肪干细胞诱导成心肌细胞研究[J];心脏杂志;2005年05期

本文编号：2560739