果糖饮食诱发的IETM在MS及其相关疾病发生中的作用：甘氨酸的保护机制

发布时间：2019-11-21 17:54

【摘要】：第一部分甘氨酸对果糖饮食致大鼠发生MS及肠黏膜屏障影响的研究目的：探讨肠源性内毒素血症(IETM)在高果糖饮食致大鼠代谢综合征(MS)中发挥的作用,及甘氨酸(glycine)对MS及肠黏膜屏障的保护作用。方法：模型组大鼠给予8%的果糖水喂养,干预组给予8%的果糖+1%的甘氨酸水喂养。每月测量大鼠体重及收缩压,分别于2月、4月、6月、8月处死动物,麻醉后腹主主动脉取血并分离血浆,迅速分离小肠上段,部分置于10%中性福尔马林,其余样本-80℃冷冻保存 1、血脂检测采用酶法测定血浆甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、总胆固醇(TC)及游离脂肪酸(FFA)水平。 2、检测血浆内毒素、胰岛素、促炎因子及胰岛素抵抗评估鲎试剂显色法检测血浆内毒素(LPS)水平；采用ELISA试剂盒检测血浆胰岛素、TNF-α及IL-10的变化；采用HOMA-IR评估胰岛素抵抗(IR)指数,计算公式为：空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(EU/mL)/22.5。 3、小肠组织病理学检测小肠组织采用常规石蜡包埋、切片,切片厚度为5μm,HE染色,镜下观测组织病理学变化；采用改良Gomori法检测肠碱性磷酸酶(AKP)的表达。结果：实验期间,大鼠状况良好,模型组大鼠3月～6月体重增加明显(P0.05,P0.01),3月后收缩压升高(P0.05,P0.01)。甘氨酸在4月、6月显著降低模型组体重增长(P0.05,P0.01),4月～6月降低模型组收缩压的升高(P0.05,P0.01)。 1、血脂变化模型组2月后血浆TG、TC及FFA水平明显升高(P0.01,P0.05),HDL-C水平显著降低(P0.01,P0.05)。甘氨酸显著降低模型组各时间点血浆TG水平,显著降低模型组6月、8月血浆FFA水平(P0.01.P0.05)。 2、血浆LPS、胰岛素、促炎因子及IR变化模型组大鼠2月后血浆LPS、胰岛素及HOMA-IR显著升高(P0.01),4月、8月血浆TNF-α及IL-6水平显著升高(P0.01)。甘氨酸显著降低模型组血浆LPS、血浆胰岛素、HOMA-IR及促炎因子(TNF-α, IL-10)水平(P0.05,P0.01)。 3、血浆LPS与HOMA-IR及FFA的相关性血浆LPS水平与HOMA-IR(rs=0.76,P=0.0164)及FFA (rs=0.65,P=0.0001)正相关。 4、组织病理学变化模型组大鼠小肠粘膜结构破坏,AKP阳性反应明显减弱,且上述损害明显表现为时间依赖性。甘氨酸干预可明显改善模型组小肠组织病理损伤及AKP表达。结论： 1、高果糖饮食可诱导大鼠发生MS,表现为肥胖、糖耐量异常、IR、异常脂血症、高血压等,这可能与伴有IETM所致的IR(特别是肝IR)密切相关。甘氨酸通过减轻IETM进而改善IR、炎症,对高果糖饮食诱导的MS发挥明显保护作用。 2、高果糖饮食所致模型组大鼠发生MS时伴有IETM,表现为肠壁结构破坏、通透性增加及肠APK表达下降。甘氨酸通过减轻肠壁结构破坏和增加小肠APK表达使高果糖饮食诱导的IETM明显减轻。第二部分IETM在果糖饮食所致与MS相关疾病中的作用及甘氨酸的保护机制目的：探讨IETM在高果糖饮食所致大鼠发生与MS相关疾病(非酒精性肝病、Ⅱ型糖尿病、代谢性高血压)中的作用,及甘氨酸的保护机制。方法：模型组大鼠以8%的果糖水喂养,甘氨酸干预组给予8%的果糖+1%的甘氨酸水喂养。每月末检测大鼠收缩压的变化。分别于4月、8月处死动物,麻醉后腹主动脉取血并分离血浆,迅速分离迅速分离肝脏、胰腺、胸主动脉及腹部脂肪组织,部分置于10%中性福尔马林,其余样本-80℃冷冻保存。 1、血浆相关指标的检测酶法检测血糖、血浆NO及FFA水平变化；ELISA法检测血浆胰岛素、TNF-α、IL-6、内皮素1(ET-1)及血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)水平变化；计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及β细胞功能指数,公式为：HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(EU/mL)/22.5, HOMA-β=20×血浆胰岛素(mmol/L)/[空腹血.糖(mmol/L)-3.5];鲎试剂显色法检测血浆内毒素(LPS)水平变化,并分析其与HOMA-IR、FFA的相关性。 2、组织病理学检测肝脏、胰腺、血管采用常规石蜡包埋切片,切片厚度为5μm,HE染色,光镜下观察各组织病理学改变。 3、免疫组化检测血管内皮源型一氧化氮合酶(eNOS)检测按照免疫组化原位杂交二步法,肝脏CD68检测采用免疫组化LP法进行。每组取5张切片,每张取5个视野,运用IPP6.0软件分析eNOs及CD68免疫反应阳性细胞数。 4、胰岛β细胞凋亡水平检测胰腺β细胞凋亡采用原位杂交二步法进行检测。每组取5张切片,每张取5个视野,运用IPP6.0软件分析细胞凋亡率。 5、RT-PCR检测内皮素-A受体(ET-AR) mRNA及脂肪组织血管紧张素原mRNA表达采用荧光定量RT-PCR分析,按-2ΔΔCt法得到标准曲线,溶解曲线和样本的相对定量。结果：实验期间,大鼠状况良好,模型组大鼠3月后收缩压升高(P0.05,P0.01)。甘酸胺在4月～6月显著降低模型组收缩压的升高(P0.05,P0.01)。 1、血浆指标变化与对照组比较,模型组4月、8月血糖、胰岛素、TNF-α、IL-6、ET-1、HOMA-IR、LPS及ANGⅡ水平显著升高(P0.01,P0.05)；血浆NO水平显著降低(P0.01)；但各阶段之间上述指标未见明显差异。甘氨酸显著降低模型组4月、8月血浆胰岛素、TNF-a及IL-6、ET-1、HOMA-IR、LPS水平(P0.05,P0.01)；明显降低4月血浆ANGⅡ水平；显著提高4月血浆NO水平(P0.01)。血浆LPS水平与HOMA-IR (rs=0.76,P=0.0164)及FFA(rs=0.65,P=0.0001)正相关。 2、组织病理学结果肝脏病理学结果显示,模型组大鼠2月发生明显脂变,8月时发展为非酒精性脂肪肝炎(NASH)。随着高果糖饮食喂养时间的延长,模型组大鼠胰岛变得肥大、增生,8月出现明显萎缩。甘氨酸干预在不同时间明显改善模型组上述组织病理损伤。8月时模型组大鼠血管中膜平滑肌仅表现为略有增生。 3、免疫组化结果 4月、8月模型组肝脏CD68阳性表达明显高于对照组(P0.01),且随时间延长阳性细胞表达数量增加；甘氨酸干预可明显降低模型组4月、8月CD68阳性表达(P0.05)。模型组在不同时间点eNOS阳性着色明显少于对照组(P0.01),且8月更加明显。甘氨酸明显提高模型组4月eNOS阳性表达(P0.05)。 4、胰岛β细胞凋亡检测结果模型组胰岛β细胞凋亡明显多于对照组(P0.01),且随时间延长凋亡细胞数量逐渐增加。甘氨酸明显降低模型组6月、8月胰岛β细胞凋亡数量(P0.05)。 5、RT-PCR结果 PCR结果显示,模型组ETA-R mRNA在4月、8月表达明显高于对照组组(P0.01)；血管紧张素原mRNA4月表达明显高于对照组(P0.01)。甘氨酸显著降低模型ETA-R及血管紧张素原mRNA表达(P0.01)。结论： 1、高果糖饮食可诱导大鼠发生MS相关的NAFLD、T2DM及代谢性高血压病。这些疾病共同的病理生理基础为IETM所诱发的IR与慢性低度炎症。 2、高果糖饮食诱导大鼠发生MS相关的NAFLD、T2DM和代谢性高血压发病中,均伴有IETM、炎症及IR/高胰岛素血症。IETM通过启动炎症机制参与IR的发生。 3、甘氨酸通过减轻IETM,进而改善炎症及IR,对MS相关的代谢性疾病(NAFLD、T2DM、代谢性高血压)发挥明显保护作用。第三部分IETM在果糖饮食诱发的早期AD样病变中的作用及甘氨酸的保护机制目的：探讨IETM在长期高果糖饮食致大鼠发生早期阿尔茨海默病(AD)病变中,对认知功能损害、中枢Aβ1-40聚集及脑组织tau蛋白过度磷酸化的影响,及甘氨酸的保护作用。方法：模型组大鼠以8%的果糖水喂养,甘氨酸干预组给予8%的果糖+1%的甘氨酸水喂养。8月末在结束认知功能实验后处死动物,麻醉后腹主动脉采血并分离血浆,迅速分离大脑皮层,部分置于10%中性福尔马林,其余样本-80℃冷冻保存。 1、血浆指标检测采用酶法分别测定血浆甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)及血糖水平；ELISA法检测血浆胰岛素变化；血浆内毒素(LPS)检测采用鲎试剂鲎试剂显色法；计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),公式为：空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(EU/mL)/22.5。 2、促炎因子检测血浆及脑组织(10%脑皮层均浆)TNF-α和IL-6的检测采用ELISA法进行。 3、血浆及脑组织Aβ1-40检测采用ELLISA试剂盒检测血浆及脑组织(10%脑皮层均浆)淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)水平。 4、脑组织病理学检测脑组织采用常规石蜡包埋切片,切片厚度为5μm,HE染色,镜下观测脑组织病理学变化。采用改良Bielschowsky法检测脑组织老年斑(SP)。 5、认知功能测试采用Morris水迷宫测试各组大鼠认知功能。 6、Western blot分析采用Western blot检测脑组织胰岛素信号转导关键蛋白胰岛素受体β亚单位(IRp)、磷脂酰肌醇3-激酶α亚单位(PI3-kα)及其磷酸化蛋白、磷酸化tau蛋白的表达。结果： 1、血浆指标变化模型组血浆TG、HDL-C、TC、FFA及血糖水平明显升高(P0.01),血浆LPS、胰岛素及HOMA-IR水平显著高于对照组(P0.01)。甘氨酸显著降低模型组血浆TG、FFA、血糖、胰岛素、LPS、HOMA-IR水平(P0.01)。 2、促炎因子变化模型组大鼠血浆及脑组织TNF-α和IL-6平显著升高(P0.01)。甘氨酸显著降低模型组血浆及脑组织促炎因子表达(P0.05)。 3、血浆及脑组织Aβ1-40变化模型组大鼠血浆及脑组织Aβ1-40水平明显高于对照组(P0.01),甘氨酸可降低模型组血浆及脑组织Aβ1-40水平,但变化无统计学差异。 4、组织病理学结果模型组大鼠CA4区部分神经细胞变性,核固缩、浓染。模型组部分大鼠大脑深层出现类似于人类AD的SP,但数量及大小均不规则。甘氨酸干预后,部分大鼠大脑深层仍存在SP,但数量减少。 5、Morris水迷宫结果模型组平均逃避潜伏期明显长于对照组(P0.01),甘氨酸可显著缩短模型组第4天、5天平均逃避潜伏期(P0.05)。空间探索实验结果显示,模型组大鼠在目标象限所占时间与总时间的百分比显著降低(P0.05),甘氨酸可显著提高该百分比(P0.05)。 6、Western blot结果模型组皮层pIRβTyr1162/1163/IRβ、p-PI3-kp85αTyr508/PI3-kp85比值显著降低(P0.01),p-tauSer262蛋白表达显著升高(P0.01)。甘氨酸显可显著提高了两种蛋白的比值(P0.01),明显降低p-tauSer262蛋白表达(P0.05)。结论：长期高果糖饮食诱导大鼠发生类似人类AD的早期病变,表现为认知功能损害、脑组织Aβ1-40水平升高、磷酸化tau蛋白表达增加及脑组织出现SP,其特征有中枢与外周胰岛素信号转导异常(IR)与轻度炎症反应。甘氨酸通过减轻IETM进而改善炎症、IR从而对模型组大鼠发挥明显的保护作用。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】