T7噬菌体展示免疫抗体库筛选阿特拉津scFv抗体的研究

发布时间：2019-11-22 16:09

【摘要】：阿特拉津,又称莠去津,是一种在全球范围内广泛使用的三嗪类除草剂。其在土壤和水体中的残留会影响人体健康并对全球生态环境造成危害。因此,对环境中阿特拉津的残留量进行实时监测和评估分析,有助于防范和应对阿特拉津所来的负面影响。目前对阿特拉津暴露风险监测和评估的方法主要是基于大型仪器,而这些方法相对耗时,且成本较高。基于免疫学抗原-抗体反应的快速检测阿特拉津残留方法则更高效、方便且经济。但免疫学方法检测的关键是要获得特异性强、亲和力高的抗体。噬菌体展示抗体库技术(Phage Display Antibody Library technology)由于能绕过杂交瘤技术或动物免疫,而成为是迄今为止发展最成熟、应用最广泛的基因工程抗体制备技术之一。免疫抗体库是指采用经过免疫后的淋巴细胞构建的抗体库。由于用于构建抗体库的淋巴细胞已经在体内经过抗原选择和亲和力成熟,因此从库容较小(105-106)的免疫库中就可以筛选到特异性强、亲和力高的抗体。本实验利用阿特拉津免疫Balb/c小鼠脾脏为抗体库基因来源构建噬菌体scFv抗体库,并用直接包被(固相)和磁珠(半固相)方法分别对scFv抗体库进行了筛选。主要研究内容和结果分述如下： 1噬菌体展示免疫抗体库的构建以提取的阿特拉津免疫小鼠脾脏总RNA为模板,经M-MLV逆转录酶反转mRNA成cDNA后,PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),SOE-PCR技术连接VH、VL和GS-linker成scFv。并将scFv与T7Select(?)10-3b载体连接,经体外包装成熟后感染宿主BLT5403扩增,得到了库容量为1.0×105,滴度为2.0×1011的抗体库。 2直接包被筛选阿特拉津特异抗体利用硅烷法对酶标板表面进行氨基化修饰,并利用活性酯法将羟基化的阿特拉津偶联在酶标板上。通过对抗体库进行3轮的“孵育-洗脱-扩增”直接包被固相筛选。特异性噬菌体富集了185倍。从第三轮筛选的洗脱滴度平板中随机挑取了16株噬菌体,经PCR验证共有9株噬菌体展示有scFv抗体。经测序发现有3株噬菌体所展示的scFv相同。另外随机挑取了3株噬菌体,构建pTIG-Trx-scFv表达载体。经IPTG诱导表达和纯化后,对得到的scFv抗体进行了ELISA和间接竞争ELISA测定,最终得到一株针对阿特拉津的特异性抗体。 3磁珠法筛选阿特拉津特异抗体利用活性酯法将羧基化的阿特拉津与氨基化的磁珠偶联,对抗体库进行了4轮半固相筛选。特异性噬菌体富集了369倍。随机从第四轮筛选的洗脱滴度平板中挑取47株噬菌体,通过噬菌体ELISA和间接竞争ELISA对噬菌体表面展示的抗体进行了亲和力和特异性验证,得到了一株对阿特拉津有特异性的噬菌体。PCR扩增抗体基因后构建表达载体,对抗体进行了表达和纯化,并对纯化后的抗体的结合和竞争活性进行了鉴定。
【图文】：

噬菌体展示

所抑制(smith，1985)。这是第一次对的噬菌体展示(ph技术的基本原理术是将外源将蛋白或肤段的基因克隆到噬菌体基因组面表达并展示。其主要特点是将特定分子的基因型与在噬菌体表面表达特定蛋白，，而在噬菌体核心中则含示在噬菌体表面的蛋白或多肤进行亲和筛选，另外噬到扩增，该技术又将选择能力和扩增能力联系到一起，从数量众多的多样化噬菌体群体中选择出能特异结合染大肠杆菌使选择出的噬菌体得到扩增和富集，如图冬生弓盛感~

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洗洗洗涤涤涤洗脱脱脱脱脱脱脱脱脱脱脱脱脱脱脱脱脱脱脱 ssssssssssssssssssssssssssssscFv活性分析析析图1一 3T7噬菌体展示scFv免疫抗体库的构建和筛选流程Figl一 3ConstruetandseleetionofT7PhagedisPlayseFvimmunedisPlaylibrary
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】