CMY-39型AmpC酶的原核表达和特性研究

发布时间：2019-11-27 08:51

【摘要】：目的：对从临床分离的弗劳地枸橼酸杆菌（标本号90757）产生的CMY-39型AmpC酶蛋白进行药物敏感试验和酶特性研究。 方法：（1）对弗劳地枸橼酸杆菌作头孢西丁敏感试验及三维试验以检测AmpC酶，提取菌株质粒进行CIT序列扩增并确定其基因分型。 （2）参照Genbank上的CMY-39型AmpC酶基因序列设计合成CMY-39基因的PCR引物，以90757号菌的总基因组作为模板，PCR扩增CMY-39的编码基因，将CMY-39的PCR产物纯化后与pGEM-T载体连接，测定CMY-39的核苷酸序列。 （3）将CMY-39基因克隆到PET-32a(+)系统进行重组，，重组质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达，SDS-PAGE电泳鉴定酶蛋白的表达。 （4）取CMY-39重组菌和原菌株进行药物敏感试验，提取重组菌的CMY-39蛋白进行三维试验和Western blot检测，并对此酶蛋白进行酶动力学检测。 结果：（1）证实90757号菌株为产CMY-39型AmpC酶的弗劳地枸橼酸杆菌，序列分析结果显示目的基因片段长1146bp，经GenBank同源性比较，目的基因的氨基酸序列与GenBank上登录的CMY-39编码基因同源性为99％，它是CMY-39的突变株，为新型的CMY基因型，GenBank登陆号为HM565135。 （2）成功构建PET32a(+)/CMY-39重组质粒，经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，得到大小为1146bp和5901bp左右的片断。 （3）SDS-PAGE电泳结果显示，重组菌株经18℃诱导过夜后可见明显特异性表达条带，分子量约60KD。 （4）药物敏感试验显示，CMY-39重组菌株保持了产CMY型酶菌株的耐药特征，对第一、二代头孢菌素和头霉素类表现为耐药，对第三、四代头孢菌素，氨基糖苷类和碳青霉烯类表现为敏感，耐药性不被β-内酰胺酶抑制剂，如他唑巴坦抑制。 （5）酶动力学数据显示，重组酶测定的Km值与原菌株相比，均有不同程度的升高，表明重组酶与底物的亲和力下降。 结论：（1）重组菌所产的AmpC酶基因型为CMY-39新基因亚型，登陆号为HM565135。 （2）在PET32a/BL21系统中成功表达重组的CMY-39型酶。 （3）重组菌与原菌株比较，对β-内酰胺类抗生素的敏感性和稳定性增加，亲和力下降。
【学位授予单位】：广州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R3416

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 赵虎,周庭银,孔宪涛;AmpC β-内酰胺酶及其分子生物学检测[J];中国感染控制杂志;2005年04期

2 张嵘,郑芳,金亚平,张正良,朱百荣,周俊;肠杆菌科细菌去阻遏持续高产Amp C酶的检测与amp D基因突变的研究[J];临床检验杂志;2003年04期

3 孙爱慧;邓晓慧;陈苏婉;郑风劲;刘小康;;质粒介导的AmpC β-内酰胺酶的研究[J];四川生理科学杂志;2007年03期

4 赵虎;涂婉;蒙杰;唐轩;;医院感染中革兰阴性杆菌AmpC β-内酰胺酶产酶率分析[J];检验医学;2009年10期

5 侯伟伟;蒋燕群;;三种AmpC酶表型检测方法比较[J];检验医学;2010年02期

6 赵虎;王寅;涂婉;方毅;庞立峰;;临床常见产AmpC β-内酰胺酶菌株中染色质ampC共同序列的研究[J];检验医学;2010年06期

7 丁家波,崔治中;pGEX载体表达马立克氏病病毒囊膜糖蛋白gI基因的最佳条件[J];微生物学报;2001年05期

8 陈晓莉;徐元宏;黄颖;储洁;王中新;;变形杆菌临床分离株的耐药性分析及其AmpC酶的检测[J];安徽医科大学学报;2007年04期

9 张冬梅;王斌;;三种细菌HPI核心区ybtE基因核苷酸序列及推导氨基酸序列的比较研究[J];安徽医科大学学报;2008年03期

10 殷俊;王迎迎;李家斌;王谦;陈燕;程君;孙震;叶英;;一株携带新的突变ampC酶基因的弗劳地枸橼酸杆菌的研究[J];安徽医科大学学报;2009年02期

本文编号：2566548