采用转基因小鼠初步探讨核仁素的心肌保护作用

发布时间：2019-11-27 21:58

【摘要】：[目的]构建在心肌中特异性表达外源性核仁素的转基因小鼠,研究核仁素在整体动物水平能否发挥心肌保护作用。[方法]①利用基因重组技术构建小鼠核仁素基因表达质粒(pcDNA3.1-Ncl),转染至H9C2细胞后,采用RT-PCR和Western-blot方法检测小鼠核仁素基因在真核细胞中的表达能力；②将具有表达能力的小鼠核仁素基因序列通过基因重组方法构建心肌特异表达外源性核仁素蛋白的表达质粒(Alpha-MyHc clone 26-Ncl),经酶切、测序验证其准确性；③制备心肌细胞内特异性表达外源性核仁素的转基因小鼠,采用PCR技术鉴定转基因小鼠基因型。采用real-time PCR方法检测转基因小鼠心肌中核仁素基因的相对含量；采用Western-blot方法检测转基因小鼠心肌组织及其他组织中核仁素蛋白的表达。④采用组织切片及HE染色法观察转基因小鼠心肌组织形态；测量心脏重量、体重、心脏重量指数；测量左室压最大上升速率(+LV Max dP/dt),观察核仁素在心肌组织高表达后对小鼠心脏形态功能是否有影响。⑤应用转基因小鼠制备心肌缺血-再灌注损伤模型,检测心肌caspase-3活性、血清肌酸激酶活性和左室压最大上升速率(+LV Max dP/dt)变化,研究核仁素对心肌缺血-再灌注损伤的影响。[结果]①成功构建核仁素真核表达质粒(pcDNA3.1-Ncl)和小鼠核仁素基因的心肌特异性表达载体(Alpha-MyHc clone 26-Ncl),制备了核仁素在心肌组织内特异性高表达的转基因小鼠。②转基因小鼠心肌组织形态、心脏重量、体重、心脏重量指数,以及正常时左室压最大上升速率(+LV Max dP/dt)与野生型小鼠相比无明显差异。③与野生型小鼠相比,核仁素转基因小鼠心肌缺血-再灌注损伤后心肌caspase-3活性降低,血清肌酸激酶活性降低,左室压最大上升速率(+LV Max dP/dt)升高。[结论]核仁素在整体动物水平能减轻心肌缺血-再灌注损伤。
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第三章结果仁素Alpha一M》·Hce一one26一Nc一质质粒(PcDNA3.1一Nd)的构建与鉴定coRI酶切位点的引物，，通过PCR方法从小鼠阅读框架序列，插入载体质粒PcDNA3.1中，咙coRI酶切鉴定。质粒酶切后电泳结果(带，大小符合载体质粒长度与插入片段长度符合小鼠核仁素基因开放阅读框架(图2)。

核仁素基因mRNA水平及蛋白质水平的表达情况。结果显示，与转染空载体(PcDNA3.l)的细胞的相比，转染小鼠核仁素表达质粒(peDNA3.1一Ncl)细胞中核仁素的n1RNA(图3)和蛋白质(图4)表达水平明显增加。该结果提示PcDNA3.1一Ncl能在真核细胞中有效表达核仁素。刊 .1232000bP1000bP750b500bP核仁素250bP600bP500bPGAPDH图3M:采用RT-PcR分析peDNA3.1一Ncl瞬时转染HgcZ细胞后核仁素mRNA的表达情况 DNAMarker;1:正常HgcZ细胞;2:转染空载体质粒peDNA3，1细胞;3:转染PcDNA3.l一Nel细胞
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

【参考文献】

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本文编号：2566777