中国汉族、藏族SMP1基因多态性研究

发布时间：2019-12-02 12:46

【摘要】：背景 1940年Levine和Stetson发现了Rh血型系统,临床研究证明该系统抗原抗体不匹配能引起溶血性输血反应、新生儿溶血病和自身免疫性溶血性贫血等疾病,其临床重要性仅次于ABO血型系统。自1990年RHD基因和RHCE基因的cDNA被克隆后,从基因结构与功能方面探索Rh血型系统的研究进展迅猛。利用基因分型技术已检测出的RH等位基因已超过180个,其中RHD等位基因120多个,RHCE等位基因60多个。国内外研究表明RH基因存在丰富的人种和民族差异,特别是在东方人中存在复杂的遗传背景差异,不仅RHH基因编码区存在多态性,而且非编码区也富有多态性。 RH基因非编码区主要包括启动子区、内含子区、侧翼序列和间隔区,这些区域对RHH基因的表达调控起着重要的作用,同时,这些区域的DNA序列也存在丰富的多态性。RHD和RHCE基因之间的间隔区主要包含下游Rhesus盒和1个SMP1基因。SMP1基因又名TMEM50A(跨膜蛋白50A),该基因第7外显子的3端非翻译区与RHCE基因的第10外显子部分重叠,在进化中高度保守。从位置推测SMP1基因多态性与特殊RHH单体型紧密连锁,该基因相关功能性突变可能与特殊单体RH的选择压力有关。当前对RH基因的编码区研究较多,对RH基因的非编码区研究很少,而对RH基因间隔区中的SMP1基因研究就更少,对藏族SMPl基因的研究未见报道。 对中国汉族和藏族SMPl基因多态性的比较研究有助于深入了解RH基因结构特点和民族遗传背景差异,探讨RHH基因非编码区在RH基因进化、重组和突变中的作用机制,揭示RHD和RHCE基因多态性的遗传背景差异。 目的 比较研究中国汉族、藏族RH基因间隔区重要元件—SMPl基因的结构特点和多态性,建立SMPl基因特异性检测方法,探讨SMPl基因多态性在RH基因进化、交换重组和突变中的作用机制,比较研究SMP1基因多态性的民族背景差异和意义。 方法 1.用Rh血型微柱凝胶分型卡和抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e单克隆、多克隆抗血清常规检测Rh抗原,RhD盐水法阴性样本用间接抗球蛋白试验确认其为Rh抗原血清学阴性,用吸收放散试验检测Del型。 2.参考GenBank中的RH基因序列(BN000065.1及NC_000001)和SMPl基因序列(NT_004610.19)设计引物,应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)分段扩增SMPl基因,PCR产物纯化后直接测序。 3.利用序列分析软件DNAMAN5.2.9和REPEATMASKER WEB SERVER(http://ftp. genom e.Washington. edu/cgi-bin/RepeatMasker)分析.SMP1基因序列和结构。 4.根据SMPl基因外显子多态性位点设计序列特异性引物(sequence specific primer, SSP),应用PCR-SSP方法检测SMP1基因1351TC多态性。 结果 1.182例随机非血缘关系广东汉族样本中共检出6种Rh表型,分别为DCCee表型104例(57.1%),DCcEe表型52例(28.6%),DCcee表型11例(6.1%),DccEE表型9例(5.0%),DccEe表型5例(2.7%),dccee表型1例(0.5%)。 2.50例随机非血缘关系西藏藏族样本中共检出5种Rh表型,分别为DCcEe表型27例(54.0%),DCCee表型14例(28.0%),DccEe4表例(8.0%),DccEE表型4例(8.0%),DCcee表型1例(2.0%),未检测到RhD阴性样本。 3.在Rh表型分布中,藏族与汉族比较存在差异。汉族DCCee表型(57.1%)频率要远远高于藏族(28.0%),二者相比有显著性差异(X2=20.65,P0.05),而藏族DCcEe表型(54.0%)频率远远高于汉族(28.6%),二者相比也有显著性差异(X2=11.29,P0.05),其他表型分布二者之间比较无统计学差异(P0.05)。 4.汉族和藏族SMPl基因全长为24066bp,由7个外显子和6个内含子组成。第1-6内含子长度分别为2017bp、2381bp、8553bp、1188bp、3818bp、和3807bp；第1～7外显子长度分别为159bp、106bp、113bp、68bp、93bp、61bp和1702bp。 5.在SMP1基因序列中,共有A碱基6631bp(27.5%),T碱基7390bp(30.7%),C碱基5026bp(20.9%),G碱基5019bp(20.9%),并散布有3个A-T富含区和34个Alu序列(SINE/Alu)。 6.汉族和藏族SMPl基因第1、2、3、4、5、6外显子未发现多态性位点,但该基因第7外显子存在1351TC和1726GA多态性。 7.1351TC多态性分析结果表明181例汉族RhD阳性样本、2例汉族RhD阴性样本,3例汉族弱D样本中共有66个样本同时存在T/C多态性,106个样本仅有CC多态性,14个样本仅有TT多态性。1351TC多态性分析结果表明50例藏族RhD阳性样本和7例RhD阴性样本中,共有32个样本同时存在T/C多态性,14个样本仅有CC多态性,11个样本仅有TT多态性。 8.在1351TC多态性分布中,汉族和藏族RhD阳性样本之间比较存在显著性差异(P0.05) 结论 1.汉族和藏族Rh表型分布特点既有相同之处,又有各自的区域分布特点。 2.汉族和藏族SMP1基因结构保守,第1-6外显子无多态性位点,仅第7外显子存在1351TC和1726GA多态性。 3.本研究成功建立SMP1基因外显子和1351TC多态性检测方法,可用于中国人SMP1基因结构研究。 4.汉族和藏族在1351TC多态性位点分布中存在显著性差异。
【图文】：

脂糖凝胶(含0.5陀/m1澳化乙锭)电泳，10风PCR产物点样，以0.5XTBE为电泳缓冲液，电压10Omv，电泳45min，凝胶成像，观察结果。(2)翻护了基因第1、2、3、4、5、6和7外显子，用1.5%琼脂糖凝胶(含0.5林g/ml嗅化乙锭)电泳，10此PCR产物点样，以0.5XTBE为电泳缓冲液，电压100mV，，电泳，3Omin，凝胶成像，观察结果。5.PCR产物分离、纯化和测序RCR产物经电泳法估计含量，浓度达到ZO0ng一400ng/此者送广州工vitrogen生物技术有限公司分离、纯化，运用Rrimer一walking方法测序长片段〔38j。6.序列分析用DNAMANS.2.9和REPEAT撇SKERWEBSERVER(http://ftp.genome.washington.edu/Cgi一bin/RepeatMasker)在线序列分析软件分析相关序列〔侧。二、结果(一)翻沪l基因第1一6内含子检测结果8例样本扩增的人杖尸了基因第1一6内含子分别在对应位置出现特异条带，图1为1例DCCee表型汉族样本醚炉了基因1~6内含子检测结果。

(三)邵沪1基因第3内含子分段扩增结果8例样本扩增的5肠O1基因第3内含子分段扩增片段在对应位置分别出现特异条带，图3为1例DCCEe表型汉族样本酬毋刁基因第3内含子分段扩增检测结果。三二一20叹)‘〕b】井10001，】，75Ob】声5心〕Obl声2501，】笋loob笼，图3邵沪l基因第3内含子分段扩增电泳结果样本为DCCEe表型汉族人样本;M为 DNAmarker(四)S胭尸f基因第6内含子nt84Obp至nt1020bp扩增结果图4为1例DCCEe表型汉族样本叹娇叮基因第6内含子nt84Obp至nt1O20bp扩增检测结果。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R394

【参考文献】

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1 周华友,兰炯采;人类Rh血型系统研究进展[J];中国输血杂志;2004年03期

2 赵桐茂;;RhD抗原变异体及其在输血中的意义[J];中国输血杂志;2008年01期

3 周华友,兰炯采,王晓珠,樊红,王毅,孟庆宝,赵祥胜,张印则;人RHD基因Rhesus盒的检测及其意义[J];中国实验血液学杂志;2005年01期

4 邵超鹏,何春辉;RHD基因3'-非编码区序列分析[J];中国实验血液学杂志;2005年02期

5 熊文;邵超鹏;李雪梅;周一炎;;Rh血型DEL表型RhD蛋白表达的研究[J];中华医学杂志;2006年02期

本文编号：2568768