血浆Exosomes生物学特征及血浆Exosomes对巨噬细胞功能影响的初步研究

发布时间：2019-12-02 22:00

【摘要】：目的： 1.研究人血浆Exosomes小体的生物学特征,了解血浆Exosomes在免疫系统中的作用。 2.通过将人血浆Exosomes小体与体外诱导分化获得的人MⅠ巨噬细胞共孵育,研究巨噬细胞的Wnt5a通路是否被血浆Exosomes小体激活。方法： 1.采用超速离心和超滤的方法分离纯化血浆外泌体样小体,从而获得无菌的血浆外泌体样小体。用透射电镜观察血浆Exosomes形态；流式检测血浆Exosomes分子表型；Western blot检测血浆Exosomes的蛋白。 2.从健康人的外周血中分离PBMCs,然后体外培养诱导获得Ⅰ型巨噬细胞。通过显微镜观察细胞形态及流式检测细胞表面分子确定培养细胞是否为巨噬细胞。将血浆外泌体样小体与Ⅰ型巨噬细胞混合培养后,提取巨噬细胞的RNA,经逆转录扩增及电泳比较未受血浆外泌体样小体刺激的巨噬细胞及受刺激的巨噬细胞的炎性因子基因的变化,如：IL1β, IL6、TNFα、IL10。用流式检测血浆外泌体样小体处理巨噬细胞不同时间段胞内Ca2+的变化,其中以Wnt5a刺激巨噬细胞胞内Ca2+的变化做阳性对照组。用Western Blot方法检测了血浆外泌体样小体刺激的巨噬细胞CamKⅡ是否发生了磷酸化。结果： 1.从健康人血浆中超速离心获得Exosomes。用透射电镜观察小体形态,这些小体形态均一,为圆形囊泡结构；采用CD63抗体包被磁珠捕获的血浆Exosomes样小体的CD81的阳性率为73.68%,17.83%的血浆Exosomes样小体表达CD86, HLA-DR阳性率为60.63%,血浆Exosomes样小体还表达黏附相关的分子CD54和CDllc,阳性率分别为14.66%和17.83%；血浆Exosomes富含有CD63和CD81蛋白,而且通过实验还发现小体含有HLA-DR、CD80、CD86和Wnt5a分子。 2.通过流式检测发现Exosomes与巨噬细胞孵育一段时间后,巨噬细胞胞浆内Ca2+平均荧光强度上调。RT-PCR检测出Exosomes对巨噬细胞的促炎因子如IL1β、IL6、TNFα的表达有促进作用,在2h时,IL1β、TNFα基因表达达到高峰,分别比对照组上调表达0.85倍和1.69倍,而IL6基因上调表达的量在4h达到高峰,是对照组的3.7倍,而对抑炎因子IL10的表达具有抑制作用。RT-PCR也检测出巨噬细胞表达Frizzled5受体,但是Exosomes对其基因的表达没有影响。Western Blot检测P-CamKⅡ蛋白发现Exosomes能使CamKⅡ发生磷酸化。结论： 1.血浆中的小体在大小及形态上跟外泌体样小体相似。这种小体也表达外泌体样小体功能相关分子,如HLA-DR, CD80和CD86,且含有丰富的功能性蛋白,因此血浆外泌体样小体可能由多种细胞分泌产生,而且在免疫系统中发挥着重要的作用。 2.初步研究发现血浆外泌体样小体能上调巨噬细胞炎症因子基因的表达,并且信号通路中的CaMKⅡ蛋白发生了磷酸化,因此可能通过活化巨噬细胞的Wnt5a- Ca2+信号通路促进炎性细胞因子的分泌。
【图文】：

血浆,流式,表型,分子

图la图lb图1电镜检测血浆Exosomes小体形态二、流式检测血浆ExosomeS分子表型CD63是ExosomeS的标志性蛋白，采用CD63抗体可捕获血浆ExosomeS样小体。流式检测血浆ExosomeS高表达CD81为73.68%，17.83%的血浆Exosomes样小体表达CD86，HLA一DR阳性率为60.63%，血浆ExosomeS样小体还表达勃附相关的分子CD54和CDllc，这些分子可能显示了血浆ExosomeS来自多种细胞。。况。胃。况。畏

血浆,未成熟,蛋白,实验组

复旦大学硕士学位论文、Westernblot检测血浆ExosomeS的免疫相关蛋白为了研究血浆ExosomeS的生物学特性，，采用WeSteI’nblot方法对ExosomeS的蛋白做了进一步研究。结果显示，人血浆Exosome:富含有CD63和CD81。而且通过实验还发现小体含有HLA一DR，CD80和CD86，说明一些血浆Ex。SomeS可能来源于抗原提呈细胞，这些重要的免疫分子可能在免疫系统中发挥作用。另外，我们还发现血浆Exosomes含有Wnt3a、Wntsa分子，为下一步研究血浆ExosomeS对巨噬细胞的作用提供了基础。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392.1

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