选择性激活星形胶质细胞对神经元树突丝运动的影响

发布时间：2019-12-06 03:09

【摘要】：背景和目的：星形胶质细胞对神经元的作用越来越受到重视,已知星形胶质细胞可以释放多种活性物质对神经元产生、突触形成以及调节突触传递等各种神经元功能起重要调制作用。除了谷氨酸,星形胶质细胞还可以释放D-丝氨酸对神经元长时程增强的产生起重要作用以及释放ATP对神经元活动产生异突触抑制,提示胶质细胞可以通过释放信号分子对突触功能具有重要调节作用。另一方面,树突棘形态和活动状态与突触功能密切相关,但有关星形胶质细胞对树突棘的影响,人们了解很少。最近用双光子成像技术的研究显示,星形胶质细胞突起的活动与其邻近树突丝的运动密切相关,星形胶质细胞的突起通过直接接触,具有稳定树突丝活动和促进树突丝的发育的作用。但星形胶质细胞是否可通过释放信号分子来调节树突丝形态和运动目前还不清楚。我们的研究目的是建立蓝光刺激胶质细胞(表达光敏感通道ChR2)对神经元树突丝形态及运动检测的模型,实现选择性激活星形胶质细胞,研究星形胶质细胞兴奋对神经元树突丝运动的影响及其可能的分子调节机制。实验方法：原代培养SD大鼠的星形胶质细胞、神经元细胞,并建立星形胶质细胞和神经元的混合培养模型。采用脂质体转染的方法将光敏感通道(Channelrhodopsin2)转入原代培养的星形胶质细胞中,当Channelrhodopsin2在细胞膜表面表达后,用470mm蓝色脉冲光(刺激模式为1Hz,800ms open,200ms closed,10次/串)照射星形胶质细胞,并用激光共聚焦显微镜观察星形胶质细胞的活动(以钙波为活动信号)。采用电转方法将荧光蛋白GFP转入神经元细胞,并用激光共聚焦显微镜观察第4-5天神经元细胞树突丝的形态和运动,同时给予100μMATP或100μM谷氨酸,观察ATP或谷氨酸对神经元树突丝的形态和运动的影响。对混合培养的星形胶质细胞给予上述模式的光刺激,同样激光共聚焦显微镜观察混合培养的第4-5天的神经元细胞树突丝的形态和运动。最后用Metamorph软件对ATP、谷氨酸或光刺激混合培养中星形胶质细胞对神经元树突丝形态和运动的影响做定量分析。结果：1.Channelrhodopsin2可以稳定表达在星形胶质细胞膜表面,并可维持一周左右的时间。我们对激活星形胶质细胞的光刺激模式进行摸索,发现模式为1Hz,800ms open,200ms closed,10次/串时对星形胶质细胞有较好的激活作用。星形胶质细胞表现出不同程度的钙波,大致分为四种情况：单次短时程钙波,多次短时程钙波,单次长时程钙波,多次即时钙波。2.在单独培养的情况下,100μM的ATP或100gM谷氨酸可以抑制处于体外培养第4-5天的神经元树突丝的运动,给药前后有显著性差异。3.在混合培养的模型中,用光刺激器选择性激活星形胶质细胞后,发现神经元树突丝的运动同样被抑制,定量分析显示有显著性差异。结论：Channelrhodopsin2可以稳定表达在星形胶质细胞膜表面,运用光刺激可以选择性激活混合培养中的星形胶质细胞。星形胶质细胞的兴奋可以抑制神经元树突丝的运动,效果与100μMATP或100μM谷氨酸类似。这表明星形胶质细胞对神经元树突丝运动的抑制作用,很可能是通过ATP或谷氨酸等神经递质的调节作用完成,该结论有待进一步实验的验证。
【图文】：

序列,光纤,星形胶质细胞,钙波

图1光刺激器LASER一WAvEn及光纤2.5激光共聚焦显微镜记录星形胶质细胞的钙波及神经元树突丝的运动chRZ在星形胶质细胞上表达后，，用终浓度为5“M的RhodZ孵育星形胶质细胞，时间为3omin一4omin。激光共聚焦显微镜的激发光选择488和cy3，物镜为20/。选择488通道可圈出转入chRZ的星形胶质细胞，然后选择cy3通道进行序列扫描(肠melapse)，参数为:Interval:3.osee;Number:500;肠talTime:25min;resolution:512‘512。所圈细胞红色荧光的强弱变化即为星形胶质细胞钙波的振荡变化。给第小5天纯培养神经元100”MATP或100抖M谷氨酸，观察这两个递质对神经元树突上fil叩edia运动的影响。对于混合培养的神经元，同样选择第小5天这

激光共聚焦显微镜,胞内钙

图2激光共聚焦显微镜IX71数据的采集和处理形胶质细胞胞内钙的测量，先通过Metamo甲h软件分析得到图片中荧光强度的大小，再通过Excel软件分析计算可以得到胞内钙含量随情况。Fifopodia运动能力的强弱以fil叩odia端点的运动速度来衡量，orph软件可以得到每两张图之间端点的移动距离，再通过Excel计算速度。两组数据间的统计学差异采用t一test。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R33

【共引文献】