GINS2基因沉默对K562细胞和NB4细胞凋亡的影响及作用机制的研究

发布时间：2019-12-06 04:42

【摘要】：PML-C与GINS2蛋白相互作用的胞内验证目的通过胞内实验验证PML-C与GINS2蛋白之间的相互作用。方法将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PML-C和文库蛋白质粒pACT2-GINS2共同转化AH109酵母细胞，，通过酵母双杂交技术验证二者在活细胞内的相互作用；构建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2两种真核表达载体并共转染人胚肾293细胞，利用免疫共沉淀技术验证二者之间的相互作用。结果pGBKT7-PML-C诱饵蛋白质粒和pACT2-GINS2靶蛋白质粒共转化AH109酵母细胞后，可见蓝色阳性克隆生长；pCMV-HA-PML-C和pCMV-Myc-GINS2真核表达载体构建成功，共转染人胚肾293细胞，用兔抗HA多克隆抗体沉淀与HA-PML-C相互作用的蛋白后，用鼠抗Myc单克隆抗体进行Western blotting检测，可以检测到Myc-GINS2蛋白。结论利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术在胞内验证了PML-C与GINS2间存在相互作用。 PML(NLS-)与GINS2蛋白相互作用的胞内验证目的：通过间接免疫荧光技术和免疫共沉淀实验验证PML（缺失核定位信号系统，NLS-）与GINS2蛋白之间的相互作用。方法：构建pCMV-HA-PML（NLS-）和pCMV-Myc-GINS2两种真核表达载体并共转染人胚肾293细胞，利用间接免疫荧光和免疫共沉淀技术在胞内验证二者之间的相互作用。结果：成功构建真核表达载体pCMV-HA-PML（NLS-）及pCMV-Myc-GINS2，共转染人胚肾293细胞，HA-PML（NLS-）蛋白使用抗HA的一抗和FITC标记的羊抗兔IgG，Myc-GINS2蛋白使用鼠抗Myc的一抗和TRITC标记的羊抗鼠IgG，在激光共聚焦显微镜下可观察到两种蛋白在人胚肾293细胞内的共定位；兔抗HA多克隆抗体沉淀与HA-PML（NLS-）相互作用的蛋白后，用鼠抗Myc单克隆抗体进行Western blotting检测，可以检测到Myc-GINS2蛋白。结论：利用间接免疫荧光技术和免疫共沉淀实验验证PML（NLS-）与GINS2蛋白间存在特异性相互作用。 GINS2基因沉默对K562细胞和NB4细胞凋亡的影响及作用机制的研究目的：通过构建GINS2的短发卡RNA干扰载体，转染K562和NB4细胞，观察GINS2基因沉默对K562细胞和NB4细胞凋亡的影响，为探寻白血病的诊疗靶点及其分子作用机制的研究奠定基础。方法：通过构建GINS2的短发卡RNA干扰载体，转染K562和NB4细胞，用G418筛选后，利用荧光定量PCR技术和免疫印迹检测干扰效果；流式细胞术检测细胞凋亡，周期情况；间接免疫荧光检测细胞周期蛋白的定位及免疫印迹检测细胞周期蛋白，凋亡蛋白和信号通路蛋白的变化。结果：成功构建五组GINS2的短发卡RNA干扰载体，在两株细胞中均有干扰效果，流式细胞术检测细胞凋亡率明显上升，细胞周期阻滞在G2期，且与CyclinB1蛋白在细胞内的定位相关；免疫印迹检测凋亡蛋白表达升高，并验证了细胞凋亡是通过P38MAPK信号通路发挥作用的。结论：GINS2基因沉默后抑制细胞生长，凋亡率升高,细胞周期阻滞在G2期，且与P38MAPK信号通路相关。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】