河豚毒素特异性单克隆抗体的制备

发布时间：2020-02-13 09:10

【摘要】：河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX)是毒性最强的非蛋白类神经毒素之一,分布广泛,因最早从河豚鱼体内分离而得名。在众多河豚毒素的检测技术中,免疫检测技术因其灵敏度高和操作简便等优点受到人们的青睐,而免疫学检测的关键要素是目标物质的特异性抗体。本研究首先以牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumi,OVA)、匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)为载体蛋白,分别与TTX进行偶联以制备人工完全抗原。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及紫外分光光度分析方法,优化了河豚毒素人工完全抗原(BSA TTX)的合成条件,并筛选出较佳的反应条件,即反应时间为72h、偶联剂添加量为12%、TTX与BSA质量比为1:5时河豚毒素免疫抗原偶联率较大。同时应用聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外分光光度法、红外光谱检测技术以及Quantity One凝胶分析软件计算偶联率等方法建立了人工完全抗原的表征体系。然后利用制备出的两种免疫抗原OVA TTX和KLH TTX免疫Balb/C小鼠,通过杂交瘤技术成功制备出两株杂交瘤细胞OVA 1E3和KLH CB2。两株细胞分泌的单克隆抗体均为IgM型,对两种单克隆抗体的特异性鉴定结果显示两种单抗均与TTX有特异性结合。此外,本研究还针对不同载体蛋白对单克隆抗体制备产生的影响机理进行了初步探讨。以疏水相互作用理论为基础,结合不同蛋白的疏水性能,推理认为KLH是一种较适合于TTX特异性单抗制备的载体蛋白。本课题的研究为河豚毒素的免疫学分析检测奠定了物质基础,对推动河豚毒素免疫学检测技术的发展具有重要意义。
【图文】：

河豚毒素

简介 etrodotoxin，TTX）是毒性最强的非蛋白类神经毒素之一，存蜥蜴、青蛙、蟾蜍、扁形虫等动物体内，某些细菌（如弧菌豚毒素[14]，因最早由日本学者田原良纯1909年从河豚鱼中发易潮解的白色结晶体，分子式 C11 H17N3O8 ，相对分子质量由 3 个氮原子组成，它们与氢氧原子形成特殊的结构。其结构个胍基, 6 个羟基，在 C 5 和 C 10 位有一个半醛糖内酯连接色粉末，纯品为无色晶体，，呈针状或菱形，无臭，无味，易醚、苯等有机溶剂，微溶于水，极易溶于稀酸水溶液。比较稳定，在中性和酸性条件下对热稳定，240℃开始碳化，溶液中易分解，在 5%氢氧化钾溶液中于 80℃~100℃可分解基喹唑啉，这也是 TTX 化学检测法的理论基础[11, 13]。

聚丙烯酰,同质,量比,图谱

Lane1. BSA +12%FALane3. BSA+ 6%FA;图2 3.B。由图差，反应条件量的偶联体系加量的反应条%的甲醛添加作为最适的偶 g. 2 3 CharacX 与 BSA 质蛋白 BSA 和偶图所示，TTXA=1:5 时条带图 2 4 TTXSpectrum of 3 非变性聚丙烯酰胺A; Lane2.TTX BSA+; Lane4. TTX BSA+3.A 可知，TT件为占总体积系，其偶联物条件下，随着反加量对载体蛋偶联剂添加量图 2 3 不同cterization cha质量比的确定偶联物在不同X BSA 凝胶条带高度差异最X 与 BSA 不同non denaturimass 4 5 胺凝胶电泳图谱+12%FA; 6%FA; 16 X BSA 凝胶条积 12%的甲醛物的分子量变反应时间的延蛋白没有破坏。同偶联剂添加arts of the di定同质量比反应条带的位置均最大，即偶联同质量比非变ing polyacrylaratio of TTX t000011bAorbsnaec 条带的位置略醛添加量时条变化较为明显延长，载体蛋坏性的变性作 B. 12%偶联加量的表征图fferent amou应条件下的非均略高于对照联物的分子量变性聚丙烯酰amide gel eleto BSA 00.20.40.60.811.21.4220 230略高于对照的条带高度差较显；此外
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

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