Ras蛋白ssDNA适配子的筛选与鉴定

发布时间：2020-02-15 18:30

【摘要】：第一部分随机寡核苷酸文库的构建及PCR反应条件的优化目的成功构建随机寡核苷酸文库,并对对称及不对称PCR反应条件进行优化,获得最优的PCR反应条件。方法设计一个两端为固定序列：5’端为23个碱基固定序列,3’端为20个碱基固定序列,中间为35个碱基随机序列的共78个碱基的随机寡核苷酸文库及相应的引物,送生物公司合成。取文库及引物直接经琼脂糖凝胶电泳鉴定。根据引物Tm值,设置12个退火温度梯度(53.3—65.3℃)、循环次数(5、8、12、16、20、24)及引物比(P1：P2=30：1、50：1、80：1及100：1)进行PCR扩增,分别对对称、直接及间接不对称PCR反应条件进行优化,经琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。结果78bp的ssDNA经3%琼脂糖凝胶电泳后,条带在40-50bp的1Obp dsDNA ladder处。经PCR扩增为78bp的dsDNA的电泳条带则在80bp的lObp dsDNA ladder附近。对称PCR反应条件的最优的退火温度为60℃,最优的循环次数为24次。间接不对称PCR循环次数为40,最优的引物比为P1：P2=100：1。直接不对称PCR未能获得目的产物。结论成功构建了随机寡核苷酸文库及相应的引物。对称PCR及间接不对称PCR反应条件优化成功,在优化的PCR反应条件下,能获得特异性高、量大的PCR产物。直接不对称PCR反应条件优化失败,但对后续实验没有影响。第二部分用SELEX技术筛选Ras蛋白ssDNA适配子目的用SELEX技术筛选Ras蛋白的高特异性及亲和力ssDNA适配子。方法把靶物质Ras蛋白用包被液包被于筛选介质96孔酶联板上,加入ssDNA文库,在SELEX结合缓冲液内结合、用SELEX冲洗液冲洗、用SELEX洗脱液洗脱,最后用DNA回收试剂盒回收结合ssDNA。再以结合ssDNA为模板,经PCR扩增,并运用间接不对称PCR及链酶亲和素磁珠技术分离获得大量的ssDNA亚文库,以此作为下一轮筛选文库,重复上述步骤进行反复筛选,直至结合率达到峰值,筛选结束。每一轮适配子及其PCR产物均经3%的琼脂糖凝胶鉴定结果。计算每轮ssDNA适配子与Ras蛋白结合率,用ELISA法检测每轮ssDNA适配子与Ras蛋白亲和力。结果间接不对称PCR和链酶亲和素磁珠技术均分离获得大量的ssDNA。每一轮适配子及其PCR产物经3%的琼脂糖凝胶鉴定,均出现在预期的目的条带。第一轮适配子与Ras蛋白结合率最低,为2.3%；亲和力OD值最低,为0.215。随着筛选轮次的增加,适配子与Ras蛋白结合率、亲和力逐渐增高,第11轮适配子结合率最高,为32.4%；亲和力OD值最高,为1.033。结论成功筛选到Ras蛋白的高特异性及亲和力ssDNA适配子。第三部分Ras蛋白ssDNA适配子的克隆、鉴定及序列分析目的对亲和力最高的一轮适配子进行克隆、鉴定及测序,获得适配子序列,分别对其进行序列分析及亲和力检测,并探讨Ras蛋白ssDNA适配子的构象与亲和力之间的内在规律。方法最终筛选得到的亲和力最高的一轮ssDNA适配子,经PCR扩增成dsDNA,回收纯化后连接pMD18-T Vector,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,随机挑选50个阳性克隆送生物公司测序。用DNAMAN 5.29软件包对单个适配子序列进行一级结构同源序列分析及二级结构预测。把获得的适配子序列送生物公司合成,并在5’端标记生物素,用ELISA法检测单个适配子与Ras蛋白亲和力。把这些适配子序列一级结构同源序列及二级结构特点与亲和力高低进行比较分析。结果50个阳性克隆子(Ral—-Ra50)中有45个的中间随机序列和预期的35个碱基数一致(Ra1—-Ra45),其中有2个序列完全一样(Ra1、Ra2)；5个不一致,其中有3个缺失1个碱基(Ra46、Ra47、Ra48),1个缺失2个碱基(Ra49),1个多1个碱基(Ra50)。寡核苷酸适配子的一级结构同源序列分析结果可分为10个家族,第1—9家族分别含有不同的保守序列,第10家族不含保守序列。二级结构主要为茎环结构,亲和力检测结果显示OD值为0.742—1.213之间。其中适配子Ra1、Ra2的OD值最高为1.213,亲和力最强,且以之为代表的亲和力强的适配子的二级结构相对以多个小的茎环结构为主；适配子Ra27的OD值最低为0.742,亲和力最弱,且以之为代表的亲和力弱的适配子的二级结构以含相对较大的茎环结构为主。多数适配子的保守序列在二级结构中多出现在茎环交界处,形成折角。结论亲和力最高的适配子克隆成功,经测序,获得了适配子序列。寡核苷酸适配子的二级结构主要为茎环结构,亲和力强的适配子的二级结构以小的茎环结构为主,具有此特征的茎环结构很有可能是我们筛选到的适配子与Ras蛋白特异性结合的结构学基础。而共同的保守序列在茎环交界处形成折角可能在其中起到了关键作用。为进一步提高适配子与靶物质的特异性和亲和力打下了基础,为后期研究Ras蛋白ssDNA适配子对VSMC增殖、迁移及CHD术后血管桥再狭窄的影响及机制提供了物质基础和一定的理论依据。
【图文】：

流程图,不对称PCR,生物素,文库

图2.1SELEX筛选流程图(二)ssDNA的准备第一轮筛选时所用的SsDNA来至随机寡核昔酸文库，所以SsDNA量以后每一轮筛选所用的SsDNA均来至上一轮筛选产物。而每一轮筛选完获得少量的SsDNA，所以，，必须获得足量的ssDNA，下一轮筛选刁‘能进分以两种方式制备SsDNA，即间接不对称PCR和链酶亲和素磁珠分离。称PCR制备SsDNA:以上一轮筛选到的SsDNA为模板，通过间接不对增获得SsDNA。链酶亲和素磁珠分离制备SsDNA:用生物素引物经对称后，经链酶亲和素磁珠分离获得SsDNA。最后均经3%琼脂糖凝胶电泳鉴ssDNA目的条带，用EzSpinColumnDNAGelExtraetionKit进行回收纯大量的ssDNA。--

琼脂糖凝胶电泳,产物,琼脂糖凝胶电泳

loobp一一50bp--一图21一6道分别为第1、适配子PcR产物(dsDNA)经3%琼脂糖凝胶电泳结果s、7、9、11轮适配子PeR产物，7道为 suLlobpdsDNAladder。 150bp-一’100bp-一’50bP---一图2.3第1、5、11轮适配子 (ssDNA)经3%琼脂糖凝胶电泳结果l一3道分别为第l、5、11轮适配子，4道为 suLlobpdsDNAladder。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R346

【参考文献】