UHRF2在生发中心B细胞成熟过程中的作用研究

发布时间：2017-03-20 15:12

  本文关键词：UHRF2在生发中心B细胞成熟过程中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：生发中心是在外周淋巴器官中为响应T细胞依赖的抗原信号而产生的一种临时结构。生发中心中的B细胞经历了大量的增殖,并筛选出可表达高亲和力抗体的浆细胞和记忆B细胞,以防御病原体的再次入侵。而保证该反应顺利进行的机制也常与B细胞的癌变密切相关,因此对该阶段的调控尤为关键。UHRF2蛋白可参与调控细胞周期、泛素化-蛋白酶体系统和表观遗传系统,故被视为调控多个细胞信号通路的枢纽。前期报道显示UHRF2可与多种细胞周期调节蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、p53、pRB、PCNA、HDAC1、DNMTs、 G9a、甲基化的H3K9以及甲基化的DNA互作,其中UHRF2可对细胞周期调节蛋白D1和细胞周期调节蛋白E1进行泛素化,进而导致细胞周期阻滞在G1期。通过整合不同的信号,UHRF2在协调细胞周期网络和表观遗传学通路中有重要作用,并且对于细胞分化起到关键作用。另外,UHRF2在多种癌症中均出现缺失,也因而被视为一个潜在的抑癌基因。为检测UHRF2在B细胞中的作用,我们首先借助流式细胞仪分选得到人扁桃体各B细胞亚群,包括初始B细胞、前生发中心B细胞、生发中心B细胞和记忆B细胞,实时定量PCR和蛋白印迹实验结果显示UHRF2在生发中心B细胞中表达量最高,进入记忆B细胞阶段后下降至接近初始水平,指示UHRF2在生发中心中可能具有重要作用。之后我们借助cas9技术构建的UHRF2基因敲除小鼠,检测了其B细胞发育的各个亚群,结果显示UHRF2基因敲除后小鼠的祖B细胞、前B细胞、未成熟B细胞、过渡期B细胞和成熟B细胞比例均没有发生明显变化,但在派氏结中的生发中心B细胞比例相较于野生型小鼠明显上升。为证实该现象,我们通过NP25-CGG免疫小鼠,两周后检测小鼠脾脏中生发中心B细胞比例的变化。结果发现相比于野生型小鼠,免疫后UHRF2基因敲除小鼠脾脏内的生发中心B细胞比例明显升高,这与未免疫状态下小鼠派氏结中的现象一致。但UHRF2基因缺失并不影响初次免疫及再次免疫后的抗体反应。研究表明过表达UHRF2可以将细胞阻滞在G1期,于是我们推测UHRF2作为控制细胞周期进行的关键环节,一旦缺失后生发中心B细胞的增殖调控将出现失控,进而导致生发中心B细胞比例上升,因此UHRF2的缺失可能是B细胞淋巴癌患者发病的一个潜在因素。
【关键词】：UHRF2 基因敲除 生发中心 B淋巴细胞
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 文献综述12-33
• 1. 生发中心反应12-23
• 1.1 生发中心反应的起始12-15
• 1.2 生发中心反应的动力学15-19
• 1.3 生发中心反应的分子调控机制19-22
• 1.4 生发中心反应与B细胞淋巴癌22-23
• 2. UHRF2蛋白的研究进展23-33
• 2.1 UHRF2的分子特征23-27
• 2.2 UHRF2在细胞调控中有重要作用27-29
• 2.3 UHRF2与疾病29-30
• 2.4 CRISPR-Cas9系统基因敲除技术构建UHRF2敲除小鼠30-31
• 2.5 小结31-33
• 第二章 实验材料与方法33-51
• 1. 实验材料33-39
• 1.1 临床样本及实验小鼠33
• 1.2 主要试剂33-34
• 1.3 主要仪器设备和耗材34-35
• 1.4 常用试剂及配制方法35-38
• 1.5 RT-qPCR引物及小鼠鉴定引物序列38-39
• 2. 实验方法39-51
• 2.1 扁桃体中B细胞亚群的分选39-40
• 2.2 提取RNA40-42
• 2.3 细胞裂解42-43
• 2.4 蛋白定量43-44
• 2.5 SDS-PAGE凝胶电泳44-45
• 2.6 Western Blot45-46
• 2.7 小鼠基因型的鉴定46-47
• 2.8 初次免疫小鼠47
• 2.9 免疫后取材47-48
• 2.10 脾脏中生发中心B细胞的检测48
• 2.11 脾脏中生发中心B细胞的流式分析48
• 2.12 ELISA48-49
• 2.13 再次免疫小鼠49-51
• 第三章 实验结果与分析51-61
• 1. UHRF2在人扁桃体中各B细胞亚群的表达情况51-52
• 2. 小鼠基因型鉴定和UHRF2蛋白水平表达检测结果52-53
• 3. 骨髓中B细胞各亚群的检测结果53-54
• 4. 小鼠脾重/体重和脾脏中单个核细胞数量的检测54-55
• 5. 脾脏中B细胞亚群的检测55
• 6. 派氏结中B细胞亚群的检测55-56
• 7. 初次免疫后UHRF2基因敲除型小鼠脾脏生发中心B细胞比例上升56-57
• 8. 初次免疫不影响UHRF2敲除型小鼠脾脏生发中心Tfh细胞比例57-58
• 9. UHRF2敲除对初次免疫后小鼠抗体分泌的影响58
• 10. UHRF2敲除对再次免疫后小鼠抗体分泌的影响58-60
• 小结60-61
• 第四章 总结与讨论61-64
• 参考文献64-70
• 致谢70

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本文编号：258000