外排泵系统参与幽门螺杆菌适应克拉霉素压力及耐药过程的研究

发布时间：2017-03-20 22:01

  本文关键词：外排泵系统参与幽门螺杆菌适应克拉霉素压力及耐药过程的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp),是一种单极、多鞭毛的革兰氏阴性细菌,寄生在胃粘膜上皮细胞的表面,很多人在儿童时期感染了幽门螺杆菌,而且很多人终生携带。幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年,世界卫生组织国际癌症研究机构将幽门螺杆菌列为I级致癌原。因此,它的根除和感染治疗成为人类需要面临的重大科学问题。目前,国际上多采用三联疗法来治疗临床幽门螺杆菌的感染,克拉霉素(clarithromycin,CLR)是新一代的大环内酯类抗生素因其易吸收,且对胃酸稳定,因此是治疗幽门螺杆菌三联疗法常用的抗生素之一。最新的马特里共识(latest Maastricht Consensus)已经将以克拉霉素为首的三联疗法列为根除幽门螺杆菌的首选疗法。但是近年来由于克拉霉素的过量和反复使用,Hp对CLR的耐药率国内外均呈上升趋势,目前对克拉霉素耐药机制的研究主要集中在Hp 23 S rRNA基因点突变的分析上。其他与克拉霉素耐药的机制在国内外未见报道,但研究中发现,许多Hp耐药菌株的23S rRNA并未发生突变,这提示了可能23 S rRNA点突变不是产生耐药的唯一因素,其耐药机制需要进一步研究。外排泵系统由一系列膜蛋白组成,根据结构的不同,可以将其分为不同的家族。细菌耐药性产生的机制有很多,包括钝化酶的产生,药物作用靶点的改变,膜通透性的改变,药物代谢等。然而,耐药产生最基本的机制是外排泵系统将药物泵出胞外。只有逃过外排泵系统的作用,仍存留在细菌胞内的药物,才会引起细菌其他的耐药机制的产生。目前在幽门螺杆菌,已经有四种转运蛋白被确认,这四种转运蛋白均属于RND家族,它们是Hp0605 to Hp0607; HefABC, Hp0971 to Hp0969; HefDEF, Hp1327 to Hp1329;HefGHI and Hp1489 to Hp1487,而且这些转运蛋白已被报道参与幽门螺杆菌的耐药。但是,构成Hp外排泵系统的转运蛋白有很多,己被确认参与Hp耐药调节的外排泵系统蛋白只有少数,这些未被报道的外排泵系统蛋白是否参与幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药调节问题,需要我们进行进一步的研究。方法1.同源重组法在Hp26695菌株中构建Hp0939缺失突变株(△yckJ)2.通过在抗性平板连续传代的方法体外诱导Hp26695敏感株产生CLR耐药。3.微量肉汤稀释法判定CLR最小抑菌浓度(MIC)。用MH肉汤将CLR做不同浓度稀释后,再接种幽门螺杆菌,孵育后观察细菌生长情况,以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。4.基因芯片比较Hp26695野生株在受CLR刺激后及未受CLR刺激时外排泵系统基因表达差异。将未经CLR刺激的Hp26695野生株以及经过CLR刺激后的野生株分别做基因芯片检测,通过两组数据比较找出CLR压力下表达情况变化最大的基因。5.Real-Time PCR法验证基因芯片结果并对Hp0939基因的重要性作进一步鉴定。将野生株用CLR处理30min后,分别提取处理后及未作处理的RNA,并反转录为cDNA,运用Real-Time PCR检测基因芯片筛选出的基因的表达。随后,我们用不同浓度CLR分别刺激野生株不同时间,我们又用不同浓度的CLR刺激耐药株,用同样的方法提取RNA,反转录,运用Real-Time PCR检测Hp0939、Hp1017基因的表达。6.平板菌落计数法,MIC测定以及荧光染色法比较Hp26695菌株及△yckJ经CLR处理后其生存率以及MIC的变化。结果1.成功体外诱导出Hp26695敏感株对CLR的耐药株。2.CLR能够引起Hp的严谨应答,多种外排泵系统蛋白参与Hp适应CLR的压力过程。将未经CLR刺激的Hp26695野生株以及经过CLR刺激后的野生株分别做基因芯片检测结果比较得出,在CLR刺激下,野生株Hp26695的外排泵系统转运蛋白中,约有47个基因发生变化,其中变化较显著的有24个(Fold(?)3)3.外排泵系统蛋白Hp0939参与Hp适应CLR过程。Real-Time PCR法验证基因芯片结果发现,外排泵系统基因Hp0939在Hp26695经CLR刺激后,表达量上调最显著(P0.05),超过对照的100倍。除Hp0939外,Hp1017表达量上调仅次于Hp0939,超过对照50倍。为了初步验证Hp0939的重要性,我们在Hp26695对CLR的耐药株中检测了Hp0939基因的表达,发现Hp0939在耐药中表达也是增高的。随后,我们用1.5MIC of CLR分别刺激野生株10min 20min 30min,并且分别用MIC 1.5MIC 2MIC of CLR刺激野生株30min,我们又用不同浓度的CLR刺激耐药株,发现Hp0939的表达均有不同程度的增高。4.在野生株Hp26695上成功构建出Hp0939缺失突变株(△yckJ)5.Hp0939基因的缺失增加Hp对CLR的敏感性。我们构建了Hp0939基因的缺失突变株△yckJ,并通过MIC测定,平板菌落计数法,以及荧光染色法比较△yckJ与Hp26695经CLR处理后生存率以及MIC的变化。发现,用3MIC的CLR分别处理两种菌,△yckJ在处理4h后存活率降到1%以下,而Hp26695与前面结果一致,处理8h后存活率仍在10%以上；荧光染色结果显示,3MIC的CLR处理后,△yckJ存活率较野生株明显降低；同样,通过对两种菌株的MIC检测发现,△yckJ的MIC较野生株下降了87.5%。6.我们在Hp26695对CLR的耐药株中检测了Hp1017基因的表达,发现Hp1017在耐药中表达也是增高的。随后,我们用1.5MIC of CLR分别刺激野生株10min 20min 30min,并且分别用MIC 1.5MIC 2MIC of CLR刺激野生株30min,我们又用不同浓度的CLR刺激耐药株,发现Hp1017的表达均有不同程度的增高。结论外排泵系统在Hp适应CLR过程中发挥重要作用,尤其是基因Hp0939(yckJ)的作用最为显著,使得细菌抵抗抗生素CLR的损害,最终使得Hp快速适应CLR环境,为进一步耐受应答,耐药株产生奠定了时间基础和物质基础。
【关键词】：幽门螺杆菌 克拉霉素 外排泵系统 yckJ
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.2
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-15
• 前言15-18
• 实验材料与方法18-35
• 实验结果35-38
• 讨论38-42
• 结论42-43
• 本研究未完成工作43-44
• 附图表44-57
• 参考文献57-62
• 致谢62-64
• 攻读硕士学位期间发表的论文64-65
• 附件65

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本文编号：258490