CaMKⅡδ在兔心衰模型中对晚钠通道的影响及其与AnkyrinG在心室肌细胞中的关联

发布时间：2017-03-20 22:11

  本文关键词：CaMKⅡδ在兔心衰模型中对晚钠通道的影响及其与AnkyrinG在心室肌细胞中的关联，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:采用兔耳缘静脉注射异丙肾上腺素(Isoprenaline,ISO)建立兔心力衰竭(heart failure,HF)模型;探讨HF时,兔心室肌细胞的晚钠电流(Late Sodium Current,INaL)的变化及KN-93(CaMKII抑制剂)对INaL的影响;同时检测心室肌组织内CaMKIIδ、磷酸化CaMKIIδ、Nav1.5、AnkyrinG的表达及CaMKIIδ和AnkyrinG定位情况;阐明HF时CaMKIIδ可能通过AnkyrinG调控晚钠通道,诱导心律失常的产生。方法:实验用日本大耳白兔,雌雄不拘,随机分为HF组和对照组(每组12只)。HF组兔经耳缘静脉注射ISO(300μg·kg-1·d-1),连续注射15天;对照组兔经耳缘静脉注射等体积0.9%生理盐水(1ml·kg-1·d-1),连续注射15天;注射完成后,均自由进食给水。(1)建立模型1月后进行超声心动图检查、ELISA法检测兔血浆BNP含量、HE染色观察心肌病理改变等来评价HF模型是否建立成功;(2)分离对照组和HF组兔心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录INaL;(3)通过Western blotting检测CaMKIIδ、磷酸化CaMKIIδ、Nav1.5及AnkyrinG的表达;(4)qRT-PCR检测CaMKIIδ、Nav1.5及AnkyrinGmRNA表达;(5)石蜡切片免疫荧光双标法标记CaMKIIδ和AnkyrinG,观察其定位情况。结果:1)造模一般结果:HF组兔在注射ISO造模过程中死亡3只、对照组兔无死亡,建立模型成功率为75.0%;与对照组相比,HF组兔的心率增加较明显(P0.01)。2)心脏超声结果显示:与对照组相比较,HF组心室腔增大、心功能降低;HF组LVEF(46.52±7.18%)较对照组(65.52±4.09%)明显下降且小于50%(P0.01);HF组LVFS(21.14±3.70%)较对照组(32.58±2.84%)明显下降(P0.01)。3)兔血浆BNP含量结果:HF组血浆BNP含量(391.40±38.59pg/ml)较对照组(234.49±31.68pg/ml)明显增加(P0.01)。4)HE染色显微镜下观察发现:对照组心室肌细胞呈长梭形、排列整齐,细胞之间的界限清楚,可见心肌横纹;HF组心室肌细胞排列紊乱、无规则,可见心室肌细胞呈空泡样变性及心室肌细胞间质水肿、纤维组织增多。5)全细胞膜片钳发现:HF组的INaL(-1.64±0.30pA/pF)与对照组(-0.70±0.17pA/pF)相比明显增加(P0.01);分别加入30nM ATXII(INa L激动剂)后,HF组中ATXII组与空白对照相比INaL明显增加、对照组中ATXII组INa L也明显增高,并且HF组比对照组增加更明显(P0.01);在ATXII诱导电流增加稳定后,分别加入1μM KN-93(CaMKII抑制剂)后,对照组中经ATXII诱导增加的INaL由(-1.39±0.29pA/pF)减少至(-0.99±0.28pA/pF),且P0.05、HF组中经ATXII诱导增加的INaL由(-2.27±0.22pA/pF)减少至(-1.87±0.25pA/pF),且P0.01。6)Western blotting结果示:HF组的心室肌组织CaMKIIδ、磷酸化CaMKIIδ、Nav1.5及AnkyrinG蛋白表达与对照组相比均明显增加(P0.01)。7)q RT-PCR结果显示:HF组中CaMKIIδ、Nav1.5和AnkyrinG mRNA表达量明显高于对照组(P0.01)。8)免疫荧光双标结果示:对照组和HF组均有绿色及红色荧光,且HF组的绿色及红色荧光与对照组相比荧光更强;对照组和HF组的绿色及红色荧光均分布在细胞内,两者在细胞膜上的同一部位表达更明显,这表明CaMKIIδ和AnkyrinG共同表达在细胞膜上。结论:1、异丙肾上腺素诱导的兔HF中,不仅Nav1.5表达上调,而且INaL也会增大。2、HF时,CaMKIIδ表达及活性增加,且使用CaMKII的抑制剂KN-93能减少INaL,说明HF时增加的CaMKIIδ能调控INaL。3、HF时,AnkyrinG表达上调,且AnkyrinG与CaMKIIδ共同表达于心室肌细胞膜上同一部位推测AnkyrinG可能调控CaMKIIδ对INaL的影响,这可能是HF时CaMKIIδ促发心律失常的机制之一。
【关键词】：心力衰竭 晚钠电流 CaMKIIδ 磷酸化CaMKIIδ AnkyrinG Nav1.5 心律失常
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.6;R-332
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 前言11-14
• 第2章 实验材料与方法14-28
• 2.1 实验材料14-18
• 2.1.1 实验动物14
• 2.1.2 实验试剂14-16
• 2.1.3 实验仪器16-17
• 2.1.4 溶液配制17-18
• 2.2 实验方法18-27
• 2.2.1 实验动物分组及动物模型的建立18
• 2.2.2 兔心脏超声心动图检查18-19
• 2.2.3 ELISA试剂盒检测兔血浆BNP含量19-20
• 2.2.4 兔心室肌组织的病理改变20-21
• 2.2.5 兔心室肌细胞的分离21-22
• 2.2.6 全细胞膜片钳记录INaL22
• 2.2.7 Western blotting实验步骤22-24
• 2.2.8 荧光定量PCR(qRT-PCR)实验步骤24-26
• 2.2.9 石蜡切片免疫荧光双标实验步骤26-27
• 2.3 统计学处理27-28
• 第3章 实验结果28-37
• 3.1 兔心力衰竭模型建立的结果28-31
• 3.1.1 造模一般结果28-29
• 3.1.2 两组兔心脏结构及心功能比较29-30
• 3.1.3 两组兔血浆 BNP 含量比较30
• 3.1.4 两组兔心肌组织 HE 染色的病理变化30-31
• 3.2 两组兔心室肌细胞的I_(NaL)及CaMKII抑制剂KN-93对I_(NaL)的影响31-33
• 3.3 两组兔心室肌组织CaMKIIδ 和磷酸化CaMKII蛋白表达比较33
• 3.4 两组兔心室肌组织Nav1.5 和AnkyrinG蛋白表达比较33-35
• 3.5 两组兔CaMKIIδ、Nav1.5 和AnkyrinGmRN A的表达35-36
• 3.6 两组兔CaMKIIδ 和AnkyrinG蛋白免疫荧光双标36-37
• 第4章 讨论37-42
• 4.1 ISO诱导兔心力衰竭模型的建立37-38
• 4.2 心室肌细胞的I_(NaL)及KN-93对I_(NaL)的抑制作用38-39
• 4.3 心室肌组织CaMKIIδ 和磷酸化CaMKIIδ 蛋白及其mRNA的表达39-40
• 4.4 心室肌组织Nav1.5 和AnkyrinG蛋白及其mRNA的表达40-41
• 4.5 CaMKIIδ 和AnkyrinG蛋白在心室肌细胞上的定位41-42
• 第5章 结论42-43
• 第6章 研究不足及展望43-44
• 致谢44-45
• 参考文献45-48
• 攻读学位期间的研究成果48-49
• 综述 心肌细胞晚钠电流的研究进展49-54
• 参考文献53-54

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本文编号：258552