沉默核仁素可诱导大鼠神经干细胞的分化

发布时间：2020-02-19 10:30

【摘要】：目的探讨核仁素(nucleolin)对原代神经干细胞(NSCs)分化的影响及其相关机制。方法构建核仁素siRNA腺病毒表达载体,将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染HEK293A细胞,包装得到具有感染能力的nucleolin-siRNA重组腺病毒。病毒体外感染原代NSCs,采用Western blot检测nucleolin蛋白的表达情况,Nucleolin-siRNA对神经干细胞Nestin、Wnt3、β-catenin蛋白表达的影响;采用免疫细胞化学检测nucleolin-siRNA对神经干细胞分化的影响。结果经酶切和测序鉴定均证实nucleolinsiRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误。Western blot检测结果显示,转染nucleolin-siRNA2的细胞nucleolin表达明显受到抑制。siRNA+组NSCs分化为NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞的分化率明显比CON组、siRNA-组增加,且差异具有统计学意义(P0.01)。与阴性对照组相比,siRNA+组Nestin的表达明显减少,Wnt3表达明显增多,β-catenin入核明显增多,其差异具有统计学意义(P0.05)。结论本研究成功地构建了针对nucleolin基因的siRNA重组腺病毒载体,沉默nucleolin可诱导神经干细胞的分化,其机制可能与Wnt信号转导通路的激活有关。
【图文】：

培养时间的增加，细胞团逐渐增大、增多，7d时生长为数十个至数百个细胞的克隆，呈球形悬浮生长，形态不规则，折光性强，周围可见混杂的其他细胞（图1A）。原代克隆的形成率在20%~30%之间。传代后出现与原代培养相同的大量次代克隆，并逐渐增大，7d后可再次传代。连续传代3次后，可见细胞团仍呈悬浮生长，形态规则，折光性强，无突起生长，周围无明显混杂细胞（图1B）。NSCs在体外传代培养后，已分化成熟的细胞会逐渐贴壁死亡，而NSCs则在培养基中悬浮生长，因此利用传代培养的方法可以纯化所培养的NSCs。ABCDEF图1SD大鼠NSCs的体外培养与鉴定Fig.1Invitrocultureandidentificationofneuralstemcells(NSCs)fromSDrats(Originalmagnification:×100).A,B:ThefirstandfourthpassagesofneonatalratNSCs,respectively;C:DifferentiatedNSCs;D:Nestin-positiveNSCslabeledwithCY3(red);E:NSE-positiveNSCsdoublelabeledwithCY3(red)andHoechst33258(blue);F:GFAP-positiveNSCsdoublelabeledwithFITC(green)andHoechst33258(blue).2.2NSCs的诱导分化及鉴定将NSCs接种至已用明胶或多聚赖氨酸包被的六孔板中，一部分仍然用含20μL/mLB27，10ng/mLbFGF，20ng/mLEGF的DMEM/F12培养基培养2h后，行nestin免疫荧光染色；另一部分加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导分化，，绝大多数细胞在24h内会贴壁，并从细胞团的边缘伸出突起（图1C）。随着培养时间的延长，越来越多的细胞从细胞团中爬行出来，伸出长长的突起，有时会交织成网。免疫细胞化学发现：NSCs标记蛋白nestin在各级克隆中都有表达（图1D）；在用10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导7d后，可见神经元细胞的标记物NSE（图1E）和神经胶质细胞的标记物GFAP（图1F）在诱导7d的细胞中表?

后出现细胞病变（CPE），表现为贴壁细胞变圆，肿胀，并逐渐从壁上脱落下来；转染10~12d后可见圆形细胞呈葡萄串状从集分布于正常的HEK293A细胞上，并出现病毒空斑。由于腺病毒载体携带了GFP报告基因，可用荧光显微镜观察。收集包装成功的病毒裂解液，转导HEK293A细胞可观察到同样的结果（图3）。图2测序鉴定3个nucleolin-siRNA表达载体的插入序列Fig.2Sequencingresultsoftheinsertsof3differentnucleolinsiRNA.A:shRNAl;B:shRNA2;C:shRNA3.ABC图3重组腺病毒感染HEK293A细胞Fig.3Nucleolin-siRNArecombinantadenovirustransducedinHEK293Acells(×100).A,C,E,G:HEK293AcellsinfectedbysiRNA-ornucleolin-siRNA1-3recombinantadenovirus(invertcontrastmicroscopy,×100);B,D,F,H:HEK293AcellsinfectedbysiRNA-ornucleolin-siRNA1-3recombinantadenovirus(fluorescencemicroscopy,×100).Nucleoli-siRNA-Nucleoli-siRNA1Nucleoli-siRNA2Nucleoli-siRNA3ABCDEFGH·878·JSouthMedUniv,2017,37(7):875-882http://www.j-smu.com

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 张敬军,夏作理,刘焯霖;神经干细胞的研究[J];泰山医学院学报;2002年02期

2 季庆;神经干细胞的研究近况[J];医学综述;2002年05期

3 刘岳文,杜永红,王可,徐正顺;神经干细胞的研究进展[J];河南科技大学学报(医学版);2003年02期

4 刘佳梅,陈东,孟晓婷;一种获得神经干细胞单细胞的新方法[J];中国康复理论与实践;2004年01期

5 王忠诚,于春江;神经干细胞研究进展[J];心脑血管病防治;2004年03期

6 杨东波,李永利,蒋传路,杨立庄;神经干细胞分化调控机制研究进展[J];中华神经外科疾病研究杂志;2004年05期

7 薛杉;张旺明;徐如祥;;神经干细胞的迁移和网络化(英文)[J];中国临床康复;2005年45期

8 张丽;顾振伦;秦正红;;神经干细胞分化为神经元的基因调控(英文)[J];Neuroscience Bulletin;2006年05期

9 刘佳梅;;脑内皮细胞与神经干细胞共培养促进神经干细胞的迁移[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2009年04期

10 张立波;邢华;许宽华;郭联庆;恽时锋;;神经干细胞的研究及前景分析[J];中国比较医学杂志;2010年10期

相关会议论文 前10条

1 王华;王文辉;林蕾;;神经干细胞的研究进展及前景展望[A];第六届西部介入放射学术会议宁夏医学会放射学分会第四届年会介入放射学新技术继续教育学习班论文汇编[C];2009年

2 戴毅;韩忠朝;;神经干细胞研究进展及临床前景展望[A];中国解剖学会第八届组织学与胚胎学专业青年研讨会论文集[C];2004年

3 孙一睿;胡锦;王尔松;奚才华;姚海军;;单层黏附培养技术在哺乳动物神经干细胞体外稳定增殖和多向分化中的应用[A];中国医师协会神经外科医师分会第四届全国代表大会论文汇编[C];2009年

4 刘佳梅;;脑内皮细胞与神经干细胞共培养促进神经干细胞的迁移[A];中国解剖学会第十一届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文汇编[C];2009年

5 魏勇;应大君;张伟;董世武;;幼龄家猪脑SVZ神经干细胞的分离与鉴定[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

6 司银楚;朱培纯;程龙;吴海霞;许红;;去皮层血管对成年大鼠脑内神经干细胞的影响[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

7 李学坤;郭安臣;左萍萍;;胎鼠海马神经干细胞的培养、鉴定及亚克隆[A];中国药理学会第十届全国神经学术会议暨浙江省药理学会2002年年会论文摘要集[C];2002年

8 李力;万琪;;小鼠神经干细胞培养及缺血神经元对其增殖、分化的影响[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年

9 李力;万琪;刘永红;张巍;;小鼠神经干细胞培养及缺血神经元对其增殖、分化的影响[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年

10 徐群渊;;神经干细胞的分离、纯化和永生化[A];中国组织工程、干细胞与神经再生学术会议论文集[C];2004年

相关重要报纸文章 前10条

1 胡德荣;“抑制蛋白”可控制神经干细胞提前分化[N];健康报;2007年

2 孙国根　白毅;灵长类脑内神经干细胞被发现[N];中国医药报;2011年

3 孙国根;阻碍卒中后神经干细胞再生的“元凶”被发现[N];中国医药报;2013年

4 ;我国科学家成功地在体外培养出神经干细胞[N];中国高新技术产业导报;2001年

5 沈丽 付钰;神奇的神经干细胞[N];科技日报;2002年

6 时仲省 高思敏 刘春阳;河南医大成功培养人胚神经干细胞[N];中国医药报;2001年

7 梓华;神经干细胞可治恶性脑癌[N];医药经济报;2002年

8 许琦敏;脑损伤修复治疗又有新希望[N];文汇报;2007年

9 北京市神经外科研究所 北京天坛医院 王忠诚邋院士;神经修复的生力军——神经干细胞[N];健康报;2008年

10 孙国根;神经干细胞并非“全能制造者”[N];中国医药报;2009年

相关博士学位论文 前10条

1 张帆;Miranda磷酸化调控果蝇神经干细胞不对称分裂的机制[D];浙江大学;2014年

2 张坤;极化巨噬细胞与脊髓来源神经干细胞联合移植对脊髓损伤治疗作用的研究[D];第四军医大学;2015年

3 褚天慈;血管生成素2对胎鼠脑皮层神经干细胞诱导分化作用及其分子机制的研究[D];天津医科大学;2015年

4 胡园园;AF1q在神经发育中的功能及调控机制研究[D];山东大学;2015年

5 张凤云;神经干细胞中PFK-1对神经发生的负调控作用[D];南京医科大学;2016年

6 郭立云;猕猴胚胎源性神经干细胞诱导、脑内移植及其在青光眼玻璃体内的转归—探索性研究[D];昆明医科大学;2013年

7 任永娟;材料调控神经干细胞的研究[D];清华大学;2009年

8 曹翠丽;大鼠神经干细胞的体外培养及向神经元的诱导分化[D];河北医科大学;2005年

9 周虎田;骨髓源神经干细胞生物学特性的研究[D];第一军医大学;2005年

10 段发亮;神经干细胞培养、增殖、迁移和分化的研究[D];第一军医大学;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 李武雄;MK-801在谷氨酸-Shh信号通路中的阻断作用[D];新乡医学院;2014年

2 冯旭;NeuroD慢病毒载体构建及在大鼠神经干细胞的过表达[D];福建医科大学;2015年

3 闫姗姗;人脐带间充质干细胞重编程为神经干细胞的调控机制研究[D];北京协和医学院;2015年

4 魏维;松果菊苷对神经干细胞体外增殖的影响[D];福建中医药大学;2015年

5 周强意;转TrkC神经干细胞联合胶原支架对创伤性脑损伤大鼠模型治疗作用的实验研究[D];北京协和医学院;2015年

6 孙爽;孕酮对Aβ_(25-35)损伤的神经干细胞增殖和分化的影响及机制研究[D];河北医科大学;2015年

7 刘磊;神经干细胞移植治疗大鼠脑梗死的实验研究[D];郑州大学;2015年

8 张涛;降钙素基因相关肽促进体外培养的神经干细胞向神经元分化[D];苏州大学;2015年

9 杨明;谷氨酸/NMDA1、Shh介导的成体NSC增殖分化信号通路的研究[D];新乡医学院;2015年

10 甘小凤;弓形虫抑制Wnt/β-catenin通路干扰C17.2神经干细胞的分化[D];安徽医科大学;2015年

本文编号：2580990