肌细胞感染后TIPE2与PCNP分子在JNK1通路中的作用

发布时间：2020-02-21 05:26

【摘要】：背景 败血症是最常见的感染性疾病之一，也是住院病人中死亡的主要原因之一。严重的败血症占进入重症监护室（ICU）治疗的病人中的1/5，也是非心脏病ICU中病人的一个主要的死亡原因。在美国，严重败血症的死亡率为28.6%，相当于每年有21.5万人死于该疾病。败血症除了造成心肝肾等器官的衰竭外，还能够引起骨骼肌的严重和持续性改变。感染性休克时，呼吸肌明显受损，感染性休克的动物模型显示，呼吸肌收缩功能下降可以造成高碳酸血症性通气衰竭和呼吸骤停。引起衰竭的原因很多，其中包括细菌内毒素，炎症因子，前列腺素，血小板激活因子，反应氧和一氧化氮，它们之间相互影响。2003年，研究人员在一次对需要机械通气的危重病人的膈肌功能进行客观评估的过程中意外地发现，这些病人的膈肌极度无力，肌力仅有健康常人肌力的20-25%。ICU病人如何导致极度呼吸肌无力的准确机制很不清楚，但是许多病人都存在有感染。至少一些病人的肌无力被认为继发于细胞因子的作用。研究发现全身感染炎症是继发膈肌肌无力的最重要的原因之一，但其机制也不清楚，相关研究也鲜有报导。本研究将寻找感染状态下(如胸腹部感染，败血症和感染性休克等)膈肌无力的主要信号转导通路，特别是JNK信号转导通路，以及其中涉及的靶基因和相应的靶蛋白，运用该基因和蛋白质的有效抑制剂(包括基因抑制和蛋白质抑制剂)，阻止感染状态下膈肌蛋白质的分解，提高膈肌的收缩功能，促进肌力的快速有效恢复。大量实验表明JNK信号通路在细胞分化、细胞凋亡、应激反应以及多种人类疾病的发生与发展中起着至关重要的作用，因此JNK信号通路是正常与疾病状态时细胞的一个重要调节靶点。研究表明，感染造成的膈肌无力的主要信号通路是p38、JNK1和PKR，而JNK信号通路在多种人类疾病如：败血症、COPD、心力衰竭、尿毒症、肿瘤等的发生与发展中起着至关重要的作用。 我们选取的靶基因是TIPE2和PCNP。TNF-α-induced protein8-like2（TIPE2）是肿瘤坏死因子(TNF)α诱导蛋白8(TNFAIP8，一个可调节凋亡的DED蛋白)家族成员之一，是与细胞死亡和炎症有关的关键信号传导蛋白，是一个对保持适应性免疫和先天免疫的稳态非常重要的蛋白因子。TIPE2优先表达于淋巴组织，肌肉组织也有少量表达。在小鼠体内，它的缺失可以导致多器官炎症、脾肿大、过早死亡。TIPE2缺陷的动物对于感染性休克异常敏感，TIPE2缺陷的细胞对于TLR和TCR的活化具有高应答性。更为重要的是，TIPE2与casepase8结合后，抑制蛋白-1和核因子-κB的活化，促进Fas诱导的细胞凋亡。对casepase8的抑制，显著的限制了TIPE2缺陷细胞的高应答性。 PEST-containing nuclear protein (PCNP)是一种与细胞周期调控有关的核蛋白，主要存在于细胞核内。这种新型的指环状蛋白是一种具有泛素化能力的蛋白连接酶，同时它可能与肿瘤的发生有关。 本实验利用内毒素作用于小鼠骨骼肌细胞C2C12细胞，制备肌细胞感染模型，同时使用JNK1抑制剂JNK1-DN（JNK1-DN，即JNK1dominant negative，具有显性负效应。机理是突变型蛋白和相关蛋白形成无功能的二聚体，野生型蛋白功能被抑制。JNK1-DN不具有正常基因产物的功能，反而通过竞争性抑制，可以抑制正常基因产物的功能。），阻断JNK通路，研究发现JNK1抑制剂明显抑制caspase3和caspase8的激活，同时发现JNK1与TIPE2及核蛋白PCNP有一定的相互关系。 目前,以JNK信号通路中活化的关键分子为靶点的膈肌无力治疗研究正在深入。在感染状态下膈肌无力的主要信号转导通路，特别是JNK信号转导通路，探讨膈肌无力的分子生物学机制以及其中涉及的靶基因和靶蛋白是我们研究的重点。 目的 通过制备肌细胞感染模型，研究JNK1信号通路中肌细胞发生凋亡的分子机制及其涉及的靶基因和靶蛋白。 方法 应用内毒素作用C2C12细胞，制备肌细胞感染模型，使用JNK1基因抑制剂，通过MTT实验方法检测对细胞增殖的影响；RT-PCR、半定量PCR检测对PCNP和TIPE2基因表达的影响；通过WB分析激活的JNK1、caspase3和caspase8，以及对C2C12细胞表面标志肌球蛋白(myosin)的影响；利用流式细胞术检测对细胞周期及凋亡的影响。同时构建了PCNP和TIPE2过表达重组质粒，测序正确后，稳转C2C12细胞，进行真核表达，并成功表达相应蛋白。通过MTT实验检测对细胞增殖的影响；利用WB实验研究JNK1、PCNP、TIPE2三者间蛋白表达的相互关系。 结果 1.成功构建了PCNP和TIPE2真核表达质粒，并在小鼠骨骼肌细胞系C2C12细胞中成功表达出蛋白。 2. LPS刺激C2C12细胞（肌细胞感染模型），可以激活JNK1通路，上调caspase3、8。JNK1基因抑制剂（JNK1-DN）显著阻断JNK1的激活，同时抑制了caspase3、8的活化。 3. JNK1抑制剂（JNK1-DN），显著上调C2C12细胞表面标志肌球蛋白(myosin)；JNK1抑制剂及PCNP都促进了C2C12细胞生长。 4. TIPE2过表达上调了JNK1，而PCNP过表达可以下调JNK1。 5. LPS刺激C2C12细胞后，C2C12细胞没有发生明显的凋亡现象。 结论 成功构建了PCNP和TIPE2真核表达质粒和肌细胞感染模型，JNK1在肌细胞感染模型中有重要的调控作用；JNK信号转导通路中相关的信号分子PCNP和TIPE2对细胞功能有影响。这些结果为提高膈肌收缩能力，改善炎症等情况造成的膈肌收缩乏力，促进呼吸功能改善的研究奠定基础。为需要呼吸肌辅助呼吸的危重病人造福。
【图文】：

使菌液充分裂解，加入350 μl溶液Ⅲ立即轻慢颠倒6-8次，12000 rpm上清小心转至吸附柱CP3内（平衡），，12000 g、离心1 min，弃去废液 μl，12000 rpm、离心1 min，弃去废液，此步骤重复两次。然后空离pm。将吸附柱移至干净的EP管内，室温静置5 min，往吸附柱膜中央滴脱液，室温放置2 min，12000 rpm、离心2 min，收集到的洗脱液即为质糖凝胶电泳和质粒酶切鉴定，筛选出的阳性克隆送 Invitrogen 公司测序 实验结果 PCNP 和 TIPE2 全长基因的扩增NP和TIPE2全长基因的扩增，电泳结果如图1-1、1-2所示。图1-1是PCR扩，扩增产物大小为554 bp。图1-2是PCR扩增TIPE2全长基因，扩增产物

使菌液充分裂解，加入350 μl溶液Ⅲ立即轻慢颠倒6-8次，12000 rpm上清小心转至吸附柱CP3内（平衡），12000 g、离心1 min，弃去废液 μl，12000 rpm、离心1 min，弃去废液，此步骤重复两次。然后空离pm。将吸附柱移至干净的EP管内，室温静置5 min，往吸附柱膜中央滴脱液，室温放置2 min，12000 rpm、离心2 min，收集到的洗脱液即为质糖凝胶电泳和质粒酶切鉴定，筛选出的阳性克隆送 Invitrogen 公司测序 实验结果 PCNP 和 TIPE2 全长基因的扩增NP和TIPE2全长基因的扩增，电泳结果如图1-1、1-2所示。图1-1是PCR扩，扩增产物大小为554 bp。图1-2是PCR扩增TIPE2全长基因，扩增产物
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 贾红轩,熊盛道,徐永健;膈肌疲劳研究进展[J];实用临床医学;2002年03期

本文编号：2581540