不同冻存时间后人脂肪干细胞特性的实验研究

发布时间：2020-03-18 08:23

【摘要】：目的:本课题旨在研究从不同冻存时间后的脂肪组织中提取脂肪干细胞在体外培养传代后诱导分化为成熟脂肪细胞,并检测脂肪干细胞增殖、成脂分化的能力及分泌的功能,为探究人脂肪干细胞冷冻保存后的生物学特性及其应用潜能提供了一定的依据。方法:抽取6例成年女性腹部或大腿脂肪并分离提纯,每人得20ml纯化脂肪。将一部分脂肪以海藻糖为冷冻保护剂分别冰冻3个月、6个月后复温,将新鲜脂肪组织及冰冻脂肪提取的脂肪干细胞在分别加入完全培养基的培养瓶中培养至第三代,取第三代脂肪干细胞在6孔板中用含地塞米松,胰岛素,吲哚美辛和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)的培养基和含胰岛素的培养基依次培养为成熟的脂肪细胞。MMT法测定不同组脂肪干细胞的生长曲线,油红染色鉴定其成脂分化能力,流式细胞术检测其表面抗原特性,ELISA法测定第3代脂肪干细胞培养基中血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)的含量从而研究其增殖、成脂分化及分泌功能。结果:1、3组中提取的脂肪细胞培养后第一天就可观察到有少许多边形贴壁细胞,然后这些细胞逐渐转变为长梭形细胞。当达到80%融合后可以观察到细胞呈长梭形,并呈平行或漩涡状的有序排列。3组脂肪干细胞生长曲线无明显差别。2、3组脂肪干细胞在条件培养基中培养均可逐渐见到细胞逐渐变短,变圆,胞质内可见微小的透亮脂滴,之后脂滴逐渐变大、融合,至14天左右成为成熟脂肪细胞,此时细胞体积变大,可见较大脂滴,有的甚至占据细胞的80%以上。3、流式细胞术显示冰冻后脂肪干细胞仍然高表达CD44、CD90,与间充质干细胞特征表型相符。冰冻保存后脂肪干细胞仍然具有间充质干细胞的特征表型。4、3组脂肪干细胞传至第3代后,长至80%融合后,用ELISA法测定其培养基中血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)的含量,VEGF含量各组间P0.05,无明显差异;HGF含量各组间P0.05,无明显差异;b FGF含量各组间P0.05,无明显差异。结论:冷冻保存6个月之内的人脂肪干细胞仍具有稳定的生物学特性,在体外定向诱导下可分化为成熟的脂肪细胞,可用于辅助脂肪移植。
【图文】：

干细胞,脂肪,生长情况,间充质干细胞

10图3.1 显微镜下观察3组脂肪干细胞生长情况注：A-D：分别为细胞提取培养后第1（×100）、4（×200）、10（×100）、16天（×100）；从左到右依次为新鲜组、冰冻3个月组、冰冻6个月组3.1.2 流式细胞术检测培养的细胞表面抗原通过流式细胞术对各组培养的细胞表面抗原表达进行检测，检测结果显示CD44、CD90 荧光强度为高表达。均与间充质干细胞表面抗原特性相符合，，表明本实验各组中所提取的细胞均属于脂肪来源间充质干细胞，且冰冻 3 个月、冰冻6 个月脂肪干细胞表型特性无明显差异。（图 3.2）A 组B ?

流式细胞术分析,干细胞,表型,吸光值

C 组图 3.2 流式细胞术分析干细胞表型结果注：A、B、C 分别为新鲜组、冰冻 3 个月组、冰冻 6 个月组的空白对照、CD90、CD44 流式结果3.2.3 MTT 法绘制细胞生长曲线图：通过MTT法测得不同时间时的吸光值，以生长天数为横坐标，吸光值为纵坐标（表1），绘制生长曲线图（图3.3）。运用统计学比较A组与B组之间P＞0.05，无统计学差异，A组与C组之间P＞0.05，无统计学差异。天数 1 4 7A组 0.22±0.04 0.26±0.02 0.31±0.01B组 0.21±0.05 0.25±0.01 0.29±0.02C组 0.21±0.02 0.23±0.06 0.28±0.04
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

【参考文献】