神经干细胞与诱导多能干细胞移植治疗帕金森病大鼠模型的比较研究

发布时间：2020-03-20 06:16

【摘要】：背景:帕金森病是多发于中老年人群的神经系统疾病之一,该病主要病机为中脑黑质区多巴胺能神经元变性或坏死,进而导致黑质纹状体系统内多巴胺能神经元含量减少。目前国内外针对帕金森病患者的治疗与试验研究已引起广大科研人员的高度重视,然而国内对帕金森病的研究仍主要停留在动物模型的实验阶段,因此建立稳定可靠的帕金森病动物模型成为深入研究帕金森病的基础。在治疗帕金森病方面,人类一直致力于寻找有效的治疗途径,目前仍以药物治疗为主,代表性药物为左旋多巴,其次就是手术和生物制剂治疗。但是随着干细胞研究在神经科学领域的迅猛发展,干细胞移植开始应用于帕金森病的治疗,为帕金森病的治疗带来了新的曙光。近些年,针对各种干细胞移植治疗帕金森病的研究相继开展,寻求一种相对有效的治疗途径成为研究的焦点。基于以上背景,本研究分别尝试移植大鼠神经干细胞和诱导多能干细胞治疗帕金森病大鼠模型,探究移植细胞的存活和分化情况,通过比较,评价移植效果,探索细胞移植治疗帕金森病的有效途径。目的:(1)建立相对理想的帕金森病动物模型。(2)掌握细胞移植技术,探索细胞移植治疗帕金森病大鼠的有效性与可行性。方法:本实验以成年雄性SD大鼠为实验动物,使用脑立体定位仪,采用6-羟多巴胺两点注射右侧内侧前脑束的方法,制备单侧损毁帕金森病(PD)大鼠模型。通过阿扑吗啡(APO)诱导旋转实验对PD大鼠模型行为学进行鉴定,通过旷场实验和露台水迷宫实验对大鼠行为学进行检测。培养大鼠神经干细胞(NSCs)和大鼠诱导多能干细胞(iPSCs),观察细胞生长、增殖、分化情况,对细胞特性进行鉴定和检测。收集生长状态较好的细胞进行移植,移植后分别从行为学和病理学方面评价移植效果。结果:(1)成功建立单侧两点损毁帕金森病大鼠模型,建模成功率高达60%以上,在术后两个月内,成功模型的数量不断增加,成功率逐渐上升。6-OHDA单侧两点注射内侧前脑束建模的方法具有稳定性好、成功率高的特点。(2)NSCs培养结果显示:细胞呈球状悬浮生长,细胞逐渐聚集增大,形成神经球,随后逐渐凋亡。在细胞生长状态良好的情况下,酪氨酸羟化酶(TH)鉴定为阳性。(3)iPSCs培养结果显示:iPSCs复苏后第4天开始换液,在第5天左右生长状态最好,表面特征性抗原及标记基因鉴定呈阳性。(4)行为学结果显示:与正常组相比,模型组、细胞移植组大鼠在旷场实验,露台水迷宫实验中行为学表现均存在显著性差异(P0.01);NSCs移植组与模型组大鼠相比,在旷场实验,露台水迷宫实验中行为学表现差异极其显著(P0.01)。iPSCs移植组与模型组大鼠相比,行为学表现具有明显差异,有统计学意义(P0.05),但治疗效果不及神经干细胞移植组。(5)病理学检测结果显示:细胞移植后第三周,与模型组相比,NSCs移植组大鼠右侧黑质区TH阳性表达量明显增多,部分神经元胞体形态逐渐恢复正常,神经元数量显著增加;与正常组相比,NSCs移植组、模型组大鼠右侧黑质区TH阳性表达量明显减少,神经元胞体形态发生变化,神经元数量明显减少。(6)Western Blot检测结果显示:NSCs移植组大鼠在细胞移植后第三周与第一周相比,TH蛋白浓度呈增高趋势,蛋白相对表达量明显增多,差异显著(P0.01)。结论:(1)本研究中,6-羟多巴胺两点注射右侧内侧前脑束制备偏侧损毁PD大鼠模型是一种高效的建模方法,所建PD大鼠模型稳定,适合用于开展帕金森疾病的干细胞移植与治疗。(2)NSCs移植治疗帕金森病大鼠模型,在细胞移植后三周内具有较好的改善效果;而iPSCs移植治疗帕金森病大鼠,在细胞移植后三周内具有一定的改善效果,但改善效果不及神经干细胞移植组,同时不同个体之间存在一定差异。
【图文】：

形态图,神经干细胞,形态

神经干细胞培养、增殖及鉴定 13.5 天的健康 SD 大鼠胚胎中脑组织中分离出的细胞进行悬液培养第一天，绝大多数呈单细胞状态，边界清楚，随着细胞密度增加，成球状，细胞间的结合程度更紧密，神经球呈增大趋势（见图 1）。大量神经球且生长状态良好时，即可传代。本实验选取传 3 代后神h 后进行神经干细胞特异性蛋白 Nestin 染色鉴定（见图 2）。通过使用液（NID），可见神经胚球向神经细胞分化，，发散出神经细胞状分支过利用神经元特异性抗原 TBR1 进行免疫荧光检测表明，可见明显见图 4）

细胞,白光

A 为复苏后第一天的 MEF；B 为复苏后第 3 天的 MEF（100×）；C（白光）、D（绿色荧光）为复苏后第 5 天的 iPSCs（100×）；A : MEF on the first day after resuscitation;B: MEF on day 3 after resuscitation;C (white light) and D (green fluorescence) are iPSCs on the fifth day after resusci
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.5;R-332

【参考文献】