山奈酚抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的分子机制研究

发布时间：2020-03-20 21:51

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,以下简称金葡菌)是一种常见的革兰氏阳性致病菌,能够产生多种毒力因子从而引起人和动物的多种疾病。另外,金葡菌能在一些留置设备表面上形成生物被膜,使其可以承受各种不利环境的影响,包括抗生素、营养限制、冷热以及免疫反应等。因此,这种形成生物被膜的能力被认为是金葡菌重要的毒力特征之一。此外,生物被膜的耐药机制也是抗生素不能作为治疗金葡菌感染的有效方法的原因之一。因此,目前急需寻找新的治疗方法来解决金葡菌感染引发的一系列难题。本研究的目的是筛选特异性抑制金葡菌生物被膜形成的抑制剂,并进一步探索其抑制作用机制,为将来抗金葡菌生物被膜药物的研发奠定基础。本实验通过在96孔板中包被冻干兔血浆模拟生物组织表面,使用金葡菌标准菌株ATCC29213建立体外生物被膜模型。从本实验室保存的多种天然小分子化合物中进行初步筛选,结果发现山奈酚具有明显的抗生物被膜活性。进一步通过倍比稀释法检测不同浓度的山奈酚对生物被膜的影响,结果显示,山奈酚在较低浓度下显著的抑制生物被膜的形成,在64μg/ml时可以抑制约80%的生物被膜。此外,在荧光显微镜下观察到山奈酚对生物被膜的抑制作用呈剂量依赖性。MIC实验结果显示,山奈酚的最小抑菌浓度(MIC)1024μg/ml;24h细菌生长曲线分析结果显示,64μg/ml,128μg/ml,256μg/ml的山奈酚不影响细菌的生长,由此可见,山奈酚特异性的抑制金葡菌生物被膜的形成,同时并不影响细菌的生长。在金葡菌生物被膜形成的不同阶段加入山奈酚,结果发现山奈酚特异性的作用于生物被膜的粘附阶段。纤维蛋白原结合实验进一步验证了山奈酚通过降低金葡菌的粘附能力从而抑制其生物被膜的形成。为进一步探索山奈酚抑制粘附的机制,通过荧光共振能量转移(FRET)的方法在体外检测山奈酚对金葡菌分选酶A(Srt A)活性的影响,结果发现64μg/ml的山奈酚对SrtA的活性抑制47%。另外,通过金葡菌表面蛋白A(SpA)展示实验,结果进一步证实山奈酚在64μg/ml时没有完全抑制SrtA的活性。根据以上结果,推测山奈酚还可能存在其他机制抑制粘附。通过透射电子显微镜和激光共聚焦显微镜观察,结果发现山奈酚处理会导致金葡菌表面蛋白大量减少;荧光定量PCR的结果进一步显示,山奈酚下调了粘附相关基因的转录水平。以上实验结果表明:山奈酚通过两种途径抑制金葡菌生物被膜的粘附阶段,一是通过部分抑制SrtA的活性从而减少粘附相关蛋白的锚定;二是通过下调粘附相关基因的转录水平从而减少粘附相关蛋白的表达。综上所述,山奈酚是一种具有全新机制的金葡菌生物被膜抑制剂,为抗生物被膜药物的研发提供了先导结构。
【图文】：

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图 1 金黄色葡萄球菌生物被膜发育过程Figure 1 The development of Staphylococcus aureus biofilm1.2.1.1 粘附（Attachment）起始的粘附阶段代表了生物被膜开始形成。无论是生物表面还是非生物表面都可以发生粘附。生物表面上的粘附对于植入医疗器械生物被膜相关的感染是十分重要的，这是因为医疗器械在植入后很快会被宿主基质蛋白所覆盖。金葡菌可以表达多种能够与宿主基质蛋白结合的表面锚定蛋白，这些蛋白统称为MSCRAMM（微生物表面成分识别粘附基质分子）[12]。MSCRAMM 拥有共同的结构，，其包括暴露的结合结构域，通常具有重复结构的细胞壁跨越结构域和负责与细菌表面共价或非共价连接的结构域。其中一部分 MSCRAMM 具有共同的细胞壁靶向基序（LPXTG），但是对于宿主基质组分如纤连蛋白，纤维蛋白原，胶原蛋白和细胞角蛋白具有不同的结合特异性。重要的是，大多数这些蛋白质与细菌细胞壁的连接依赖于分选酶家族，其中最重要的是分选酶 A，它

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图 1.1 金葡菌 ATCC29213 生物被膜抑制剂的筛选结果Figure 1.1 The result of inhibitor of S.aureus ATCC29213 biofilm2 不同浓度的山奈酚对金葡菌 ATCC29213 生物被膜的抑制效果前面的实验结果已经证明山奈酚在 512μg/ml 时可以明显的抑制生物成，接下来为了检测低于这个浓度的山奈酚是否还可以抑制生物被膜通过定量测值检测效果。结果如图 1.2 所示，山奈酚在较低浓度下便金葡菌 ATCC29213 生物被膜的形成，在 64μg/ml 时便可以抑制约 80%膜。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378.11

【参考文献】