肺炎支原体P116-N末端特异蛋白的表达及多克隆抗体制备的研究

发布时间：2020-03-21 00:43

【摘要】：目的研究肺炎支原体MP特异性蛋白之一(P116-609)及其多克隆抗体的制备。并用制备的特异性蛋白联合实验室先前表达的P1蛋白特异性抗原一起检测收集的血清样本,分析其特异性及其敏感性。方法P116-609蛋白的表达及ELISA方法的建立:-80度冰箱取出肺炎支原体标准株FH-MP,进行复苏。然后利用MP快速培养基进行培养,从阳性的培养液中提取基因组DNA作为模板。参考文献设计特异性引物进行普通PCR技术扩增获得P1116-609目的基因片段。将获得的目的基因片段进行纯化,连接到T载体上。待送完公司检测正确后,进行双酶切纯化,然后连接到pQE80-L载体上。将构建好的质粒转化入DH5α感受态大肠杆菌中,进行涂板37度恒温箱中培养,挑取单个菌落进入5 ml LB培养基中,放置于250 r/min恒温摇床上摇菌,16 h后离心留取细菌沉淀。用DNA质粒提取试剂盒,对其进行质粒提取。提取的质粒进行浓度测定,然后进行双酶切。将酶切后的溶液进行琼脂糖电泳,在紫外灯下进行观察拍照。从观察的结果好坏挑选出合适的菌液作为菌种保存。目的蛋白的表达:复苏保存的菌种,进行小量的表达,留取诱导前后的菌液进行SDS-PAGE电泳,观察细菌目的蛋白的表达情况,摸索出蛋白表达的最适合条件。确认菌种的目的蛋白表达符合预期效果后,进行细菌的大量摇菌,离心沉淀,用100 ml配制好的裂解液B进行冲悬,加入蛋白酶抑制剂和细菌裂解液。总个过程在冰上操作。放置20 min后,进行超声破碎:300 Hz 5 s,间隔5 s,总时间18 min。破碎后的液体进行10000r/min离心处理,留取上清。然后在沉淀里加入50 l裂解B,冲悬后在进行离心,留取上清液保存备用。再用诱导前后的菌液、上清粗蛋白、包涵体蛋白进行SDS-PAGE电泳,再用考马斯亮蓝进行染色1 h,再用脱色液进行脱色12小时。观察目的蛋白表达的情况。最后用配制好的不同酸碱度的洗脱液进行洗脱,留取洗脱液,再进行SDS-PAGE电泳,对胶体进行染色,观察目的蛋白主要在哪个梯度的洗脱液里面。留取主要含有目的蛋白的洗脱液,保存备用。再用NIE柱进一步洗脱纯化目的蛋白,保存备用。多克隆抗体的制备:从安徽医科大学动物试验中购买新西兰大白兔进行分组后,分四周,每周对新西兰大白兔进行目的蛋白免疫。第一二周蛋白溶液与完全福氏佐剂混合注射,第三四周蛋白溶液与不完全福氏佐剂混合注射耳缘静脉。最后从新西兰大白兔耳缘静脉抽取静脉血进行Western-blot试验,观察多克隆抗体的效果。用ELISA方法进行多克隆抗体效价检测,确定抗体的效价以备后续试验应用。用同样的方法进行实验室保存P1蛋白菌种复苏,表达出目的蛋白。然后和自己表达的P116-609蛋白一起进行收集血清的MP检测,比较单个特异蛋白检测和联合检测的特异性和敏感性的差别。结果成功构建好了P116-609基因质粒,并较好的进行蛋白表达纯化,通过Western-blot方法验证了所表达的目的蛋白和收集的MP感染病人血清的免疫反应性。而与其他的未感染病人血清没有免疫反应性。将表达的P116-609蛋白与P1蛋白作抗原包被96孔板,和购买的商用试剂盒进行特异性和敏感性分析。发现用这两种MP特异蛋白联合检测的效果有较大的提高。用自己表达的蛋白免疫新西兰大白兔,获得了较高效价的此蛋白的多克隆抗体。结论实验初步验证了P116-609目的蛋白对检测MP血清有较好的免疫原性。同时联合P1蛋白包被96孔板,对提高血清检测的特异性和敏感性都有较大的作用。P116-609目的蛋白免疫新西兰大白兔获得的较高效价的多克隆抗体为后续的MP黏附抑制试验提供了一些理论帮助。
【图文】：

图 1 MP 菌株的培养结果1：空白对照组；2：菌株培养Fig. 1 MP strain culture results1: blank control group; 2: strain 液的鉴定

培养液,鉴定结果,条带

图 2 MP 阳性培养液鉴定结果M：Marker; 1：扩增产物条带位置Fig. 2 MP positive culture fluid identificationM: Marker; 1:Amplified product band positi
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392-33

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