大肠杆菌cAMP-CRP途径调控Ⅰ型整合子中耐药基因盒表达的机制研究

发布时间：2020-03-21 03:02

【摘要】：细菌中日益严重的抗生素耐药性问题已经成为人类面临的最大健康威胁之一。抗生素的滥用是造成这一问题的主要原因。环境中残留的抗生素不仅可以形成选择性压力赋予耐药性细菌生存优势,有利于抗生素耐药性基因(ARGs)在同种以及异种细菌之间水平转移;还可以通过对载有ARGs的整合子等可移动遗传元件进行调控来促进耐药基因传播。Ⅰ型整合子结构较为典型,通常由5'保守区、可变区、3'保守区三部分组成。Ⅰ型整合子的5'保守区含有Ⅰ型整合酶编码基因(intI1),特异性重组位点(attI)以及基因盒启动子(Pc)。本实验室通过测序分析发现用于本课题研究的大肠杆菌的Pc位于intI1编码区内,Pint位于intI1编码区外,Pc,Pint方向相反且有一段重复序列。这就为整合酶以及基因盒的共调控提供了一定的依据。的确,有研究发现在霍乱弧菌中整合酶和基因盒的表达是共调控的。根据Pc启动子-10区和-35区的不同,Pc启动子可分为不同的种类,通过本实验前期的工作发现济南水环境中Pc启动子检出频率居于前3位的分别是PcW、PcWTGN-10,PcH1。Pc上游有一段与-10区部分重复的序列,该部分为一可能的cAMP-CRPbox,Pint上游-10区有一典型的LexAbox。cAMP-CRP是碳阻遏调控途径的蛋白复合物,而LexA蛋白为SOS调控的关键蛋白,因此我们可以推测SOS途径或者cAMP-CRP可以对整合酶和基因盒进行调控。已有研究发现整合酶可以被SOS途径和cAMP-CRP途径共同调控且两条途径是独立的。SOS途径和cAMP-CRP途径都可以对环境压力做出反应,而环境中残留的抗生素于细菌而言就是一种环境压力。本实验室欧阳润泽发现recA阴性菌株被微量抗生素诱导之后其整合酶的表达被诱导,这也证明了整合酶可能被cAMP-CRP所调控。然而环境中抗生素的残留以及SOS和cAMP-CRP途径对基因盒又有着怎样的影响呢,立足于这一点,本课题将主要就微量抗生素以及cAMP-CRP途径对几种不同的Pc变体的耐药基因盒的调控展开研究。在实验室已有的工作基础上我们使用基因工程技术敲除了原有实验菌株的crp基因,得到了 crp阴性菌株(crp-)。然后利用同源重组的原理构建了 Pc(PcW、PcWTGN-10,PcH1)及Pint双向启动子载体,将其转化或敲入到目标菌株(依次为recA+,crp+菌株;recA+,crp-菌株;recA-,crp+菌株;recA-,crp-菌株)中。然后使用微量浓度的不同种类抗生素处理转化或者敲入有双向启动子的菌株,一方面通过qPCR的方式检测微量抗生素处理后实验菌株crp基因转录水平的变化,另一方面再通过qPCR和报告基因检测的方式来探究微量抗生素处理后相应菌株的整合酶和耐药基因盒的转录与表达情况。结果发现微量抗生素处理菌株之后crp的转录水平均表现出上升趋势,也就是说环境中残留的抗生素可以诱导细菌crp基因的表达,从而使cAMP-CRP复合物含量升高,进而激活cAMP-CRP途径。部分微量抗生素处理crp+和 crp-菌株之后比较其耐药基因盒的转录水平与表达水平,发现含有crp+菌株中基因盒转录和表达水平高于crp-菌株中,这说明部分抗生素可通过cAMP-CRP途径对耐药基因盒的表达进行调控。残留在环境中的抗生素一方面可通过调控整合酶的表达增强整合酶对耐药基因盒的剪接与整合能力,另一方面通过本课题的研究我们可以发现环境中残留的抗生素还可以通过诱导耐药基因盒表达的方式使细菌耐药性提高。本研究将使我们深化对抗生素诱导调控抗生素耐药性的机制的认识,并为抗生素耐药性的控制提供理论基础。
【图文】：

序列分析,整合酶,耐药基因

山东大学硕士学位论文逡逑在以上所述几种整合子类型中，Ｉ型整合子结构是最为典型的（见图１，２），逡逑通常由？５＇保守区（５＇0）１＾１＾（１８６抑邮，５’0８）：５＾：８含有三大不可缺少的部分，既逡逑Ｉ型整合酶编码基因（／故／７）；特异性重组位点（ａ？／）；基因盒启动子（Ｐ。）。②可变逡逑区（Ｖａｒｉａｂｌｅ邋ｒｅｇｉｏｎ，ＶＲ）：邋ＶＲ区通常含有一个或数个基因盒，基因盒是由一个结逡逑构基因及整合性位点组成的一种较小的可移动性ＤＮＡ元件。结构基因主要逡逑编码对抗生素的耐药性，目前，有超过１３０种基因盒已经被发现，这些基因盒可逡逑以赋予几乎已知所有抗生素［１７］，这些基因盒一般没有自身所特有的启动子，而逡逑是由位于５＇ＣＳ的Ｐｃ所启动。ＶＲ区不属于埋整合子中必然存在的结构。③３＇保逡逑守区０３＇￡：0１１８６１＾｛１８６８６１１１６１＾，３＇匚８）：１型整合子的３＇0８通常含有么＠0￡＇（溴化乙淀逡逑耐药基因）、似／八磺胺类耐药基因）以及一些明功能未知的开放式阅读框0ＲＦ５［１８］。逡逑Ｉ型整合酶属于酪氨酸蛋白家族，其催化活性区域与酪氨酸重组家族相似且逡逑都含有保守性区域（Ａｒｇ１４６－Ｌｙｓｍ－Ｈｉｓ２７７－Ａｒｇ２８（）－Ｈｉｓ／Ｔｒｐ３（Ｂ）邋［１９］，能够对含有特定逡逑序列的（非回文结构）和（回文结构）进行识别

碳代谢,途径,碳源

而Ｐｃ位于Ｉ型整合酶编码区，故ＳＯＳ途径可能会对基因盒启动子Ｐｅ起到调控作用。逡逑１．３．邋３邋ＣＡＭＰ－ＣＲＰ途径对Ｉ型整合酶表达的影响逡逑ｃＡＭＰ－ＣＲＰ途径是细菌中的关键碳阻遏调控途径［２６］（如图１．４所示），当细菌逡逑的生存环境中高效碳源（如葡萄糖）存在时，环磷腺苷（ｃｙｃｌｉｃＡＭＰ，ｃＡＭＰ）处于较逡逑低的水平，因而利用低效碳源（如几丁质）的基因表达处于未被激活的状态。当细逡逑菌生存环境中高效碳源含量降低时，细菌体内腺苷环化酶（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ邋ｃｙｃｌａｓｅ）表达逡逑水平提高，从而使得ＡＴＰ转化成为ｃＡＭＰ，后者进一步结合ＣＲＰ蛋白形成逡逑ｃＡＭＰ－ＣＲＰ复合体并激活低效碳源利用所需基因的表达。该途径也被发现能够对逡逑的生理功能做出响应，，如群体感应，细菌毒力，环境压力等。由于ＣＲＰ结合位逡逑点距离Ｉ型整合子中Ｐｉｎｔ的转录起始位点仅有７０碱基对左右，且低效碳源和外界残逡逑留抗生素在本质上都是环境压力，这不禁让人们怀疑是否ｃＡＭＰ－ＣＲＰ途径和ＳＯＳ逡逑途径类似也能够调控Ｐｉｎｔ的表达水平。的确
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378.21;Q933

【参考文献】