基于级联链置换和非酶循环扩增的HIV电化学生物传感研究

发布时间：2020-03-21 15:08

【摘要】：目的:人类免疫缺陷病毒(HIV)是引起人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体。根据世界卫生组织的数据,HIV的早期诊断对控制其传播有着至关重要的意义。本研究采用级联的toehold介导的链置换反应(TMSDR)和非酶的目标物循环扩增(TRA)实现信号的放大,构建双信号电化学生物传感系统对HIV相关基因进行高灵敏特异性检测,以期实现对HIV进行早期诊断。方法:1.电化学生物传感检测系统的构建和表征:以目标链促发级联的toehold介导的链置换反应同时启动非酶的目标物循环以期实现信号的放大,以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PEAG)、荧光分光光度法、电化学阻抗谱法(EIS)对设计的方法和传感器的组装进行可行性分析和表征。2.电化学生物传感检测系统的条件优化:对影响检测的反应条件进行优化,主要包括检测探针的浓度和固定时间、反应物的比例、反应时间和温度等。3.电化学生物传感检测系统的性能评价:以方波伏安法(SWV)作为电化学检测方法,对传感器的线性检测范围、灵敏度、特异性、准确度以及重复性进行评价。结果:1.通过不同方法证明设计的方法具有可行性,传感器成功构建。2.基于TMSDR和非酶的TRA的电化学生物传感系统,其线性检测范围为1 pM到10 nM,检测低限为0.88 pM(S/N=3),具有较好的特异性能够识别单碱基错配,准确度和重复性亦较为优异。结论:本研究构建了一种电化学DNA生物传感器用于高灵敏特异性地检测HIV相关基因。本研究构建的传感器具有双信号、非酶扩增以及反应条件温和的特点。级联的链置换反应和双重氧化还原标签的双信号识别保证了方法的特异性能够识别单碱基错配。在稀释的人血清中亦表现出了很好的检测能力,说明其具有在复杂样本中进行检测的能力。再者,通过改变检测探针的序列,可以对其它核酸进行检测,故其在核酸检测方面具有较好的应用潜力和价值。
【图文】：

级联链,信号,基团,双链

并暴露出 5'末端作为 toehold 区域与 target 进行杂交。当有 target 存在的其与 CS 的 5'末端的 toehold 区域杂交，TMSDR 促发核酸链的分支迁移，BS 置换下来。随后，trigger 与 CS 的中间区域杂交，同样通过 DNA 的，MB-AS 和 target 均被置换下来，释放的 target 启动新一轮反应形成了放大的机制。循环放大机制促使大量带有信号基团的 MB-AS 释放，以敏检测。MB 和 Fc 作为具有电活性的氧化还原标签在该生物感应体系signal-off/on”电化学信号（如图 1B）。首先，Fc-P1 / P2 双链 DNA 检过 Au-S 键自组装在金电极的表面。由于 Fc 信号基团靠近电极表面，故的电流信号较强。当 MB-AS 将 Fc-P1 置换下来形成 MB-AS / P2 双链时信号基团远离电极，信号减小，同时 MB 信号基团靠近电极，信号增大个信号基团总变化值与 target 浓度的相关性进行检测。同时产生两个氧流信号使得检测精确且灵敏，可显著提高方法的检测性能。

曲线,荧光,基团,混合液

核酸传感检测系统的表征光光度法表征实验 target 置换下来，BS 又可将带有 FAM 基团的 P3 从光基团与淬灭基团远离，荧光恢复。图 2 中 a 曲线，S混合液，其荧光强度较弱，表明 FAM 基团被 Dabcyl 和荧光探针的混合液中加入 trigger 后，因为背景信号曲线, 在 SP 和荧光探针的混合液中加入 target 以后，的增幅，，说明 target 将 BS 置换了下来；d 曲线,在 SP 入了 target 和 trigger 后，荧光强度较 b 曲线上升了 550充分说明了无酶的 TRA 和 trigger 对于信号放大的重要
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373;TP212

【相似文献】