FoxP3过表达腺病毒转染小鼠骨髓源性未成熟树突状细胞产生的外泌体分离纯化、鉴定与FoxP3蛋白分析

发布时间：2020-03-22 02:18

【摘要】：目的:FoxP3过表达腺病毒转染小鼠骨髓源imDC可以诱导免疫耐受,产生的外泌体具有多种优点,是潜在的治疗方案。本实验采用FoxP3过表达腺病毒转染小鼠骨髓源imDC,分离其产生的外泌体,并对其进行鉴定与蛋白分析。方法:1小鼠骨髓源性imDC细胞的培养以及纯化在无菌条件下剥离小鼠股骨,细胞培养液冲出骨髓,裂解红细胞,收集剩余细胞,加入含胎牛血清和细胞刺激因子的细胞培养基培养。分别于第48h、第96h更换培养液,第6天收集细胞,计数,每10~8个细胞加入100μl CD11c免疫磁珠和400μl buffer置于4℃冰箱孵育15min,分选,收集阳性细胞。2 FoxP3过表达腺病毒转染imDC纯化的imDC离心,倒掉大部分细胞上清。按照转染复数MOI=500加入相应病毒量培养15min。以细胞浓度约10~5/ml种于24孔板中培养24h。收集细胞,洗涤,用含无外泌体胎牛血清的RPMI-1640继续培养72h。3 imDC分泌的FoxP3表达鉴定荧光显微镜动态观察细胞培养过程中FoxP3表达状况。细胞培养至72h,收集细胞,Western-blot检测细胞FoxP3表达。4 imDex分离纯化收集细胞混悬液,离心除去细胞以及细胞碎片,加外泌体提取试剂盒,混匀,室温静置12h,离心收集外泌体。5 imDex鉴定电子显微镜观察imDex形态,Western-blot检测imDex特异性标记CD63。6 imDex FoxP3蛋白分析Western-blot检测imDex FoxP3表达。结果:1 imDC形态观察细胞培养第48h:形状不规则,贴壁生长。第96h:细胞开始出现突起,集落生长。第6天:细胞有细小树突状突起,半悬浮生长,符合imDC生长形态。免疫磁珠分选后观察:细胞活力较好,绝大部分细胞具有细小树突状突起。2转染后imDC FoxP3表达鉴定荧光显微镜示:转染后第12h细胞活力良好,大部分细胞开始出现荧光,持续至第72h荧光表达呈高峰,细胞活力变差,部分死亡。转染后培养第72h,Western-blot显示:与对照组(等滴度同体积空白腺病毒)相比,FoxP3过表达腺病毒组FoxP3表达明显升高(P0.05)。3小鼠骨髓源imDex鉴定透射电镜示:外泌体呈圆形或椭圆形,直径约为50-100nm左右,符合外泌体形态特征。Western-blot检测:外泌体特异性标志蛋白CD63呈高表达,结合形态学特征,进一步确定提取物为外泌体。4 imDex FoxP3检测结果转染后培养第72h,Western-blot显示:与对照组(等滴度同体积空白腺病毒)相比,FoxP3过表达腺病毒组产生的imDex FoxP3表达明显升高(P0.05),证明外泌体携带imDC来源的免疫抑制因子。结论:1本实验成功利用FoxP3过表达腺病毒转染小鼠骨髓源性imDC,并检测到imDC中FoxP3高度表达。2本实验利用电镜以及Western-bolt的方法,对外泌体进行了鉴定。3本实验成功检测到FoxP3过表达imDC所产生的外泌体高表达FoxP3,证明其携带imDC的免疫调节信息。4本实验创新性利用imDex小分子可以透过血脑屏障等优点,为MS等神经免疫疾病的治疗提供了实验基础。
【图文】：

图 1 细胞培养第 48hof Cell Culture: The cells are small, there is no dendrcolonies

图 1 细胞培养第 48h图 1 细胞培养第 48hof Cell Culture: The cells are small, there is no dendrcolonies
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 陈荣华;;Th22细胞及其细胞因子在急性淋巴细胞白血病表达水平及其意义分析[J];中国实验血液学杂志;2013年04期

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本文编号：2594311