APR3蛋白的亚细胞学定位及其在细胞凋亡和自噬中的作用

发布时间：2020-03-22 06:35

【摘要】：目的:明确凋亡相关蛋白3(apoptosis related protein 3,APR3)的亚细胞学定位,并探讨其在细胞凋亡和自噬中的作用。方法:采用生物信息学方法对APR3蛋白的信号肽、跨膜区、糖基化情况进行预测,并采用Real-time PCR和Western blot检测APR3在小鼠各器官组织及多种细胞株中的表达。利用Percoll法蔗糖密度梯度离心技术获得小鼠肝脏组织溶酶体组份,并进行Western blot分析,检测APR3蛋白与溶酶体膜标记蛋白LAMP1在各亚细胞组份及溶酶体中的丰度;采用免疫荧光共聚焦方法探讨APR3与LAMP1或溶酶体示踪剂Lyso-Tracker Red共同定位情况,以及构建的APR3蛋白真核表达载体(pFUGW-APR3)表达的外源性APR3蛋白的亚细胞定位特征。APR3表达载体(pFUGW-APR3)和沉默载体(pLL3.7-APR3)转染NIH 3T3细胞,采用CCK-8和xCELLigence活细胞计数法、碘化丙啶染色细胞流式细胞术等,检测APR3对细胞增殖活力、细胞周期、细胞溶酶体膜通透性、溶酶体腔pH、溶酶体腔多种酸性水解酶活性(如组织蛋白酶、酸性磷酸酶、酸性脂酶和β-半乳糖苷酶等)等的影响;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,采用透射电镜技术检测细胞形态的变化;采用Western blot法检测APR3对凋亡相关蛋白BAX、BAD、BCL-2和cleaved caspase 3表达的影响,以及自噬相关标记蛋白Beclin1和Map1LC3B表达的影响;利用小剂量Rapamycin刺激后,观察APR3蛋白对phos-mTOR和p62蛋白表达的影响。结果:生物信息学预测结果显示APR3是一个含有信号肽、单重跨膜的糖基化蛋白,Real-time PCR和Western blot检测发现其在多种组织器官和细胞株中均有表达,其中在小鼠脾脏、肾脏、肝脏、肺、脂肪组织和部分肿瘤细胞株中具有相对较高的表达。对亚细胞器组份的Western blot检测发现APR3蛋白与LAMP1蛋白表达具有高度的重叠,免疫荧光双染色结果也显示APR3和LAMP1具有相同的细胞学定位特征,并且与溶酶体示踪剂Lyso-Tracker Red具有相同的细胞器定位;NIH 3T3细胞转染外源表达质粒后免疫荧光染色显示外源性APR3与Lyso-Tracker Red具有相同的细胞器定位,并且出现部分定位失真现象,即在细胞膜中亦出现表达。NIH 3T3细胞株中外源性APR3蛋白过表达降低细胞的增殖活力,细胞出现细胞周期阻滞,阻滞于G1/S期,同时伴细胞周期蛋白cyclin D1表达下降,细胞凋亡促进因子BAX、BAD和cleaved caspase 3表达升高,凋亡抑制因子BCL-2表达下调,自噬相关标记蛋白Beclin-1和Map1LC3B表达增加;外源性APR3蛋白过表达还使细胞溶酶体膜通透性增加,溶酶体腔pH降低,溶酶体腔组织蛋白酶B、酸性磷酸酶、酸性脂酶和β-半乳糖苷酶活性增加;与此相反,APR3基因沉默则使溶酶体膜通透性显著下降,溶酶体腔pH升高,但不影响溶酶体腔相关酶活性;小剂量Rapamycin使APR3过表达细胞凋亡和自噬相关标记蛋白的表达发生进一步变化(BAX升高、BCL-2下降、Beclin 1和Map1LC3B表达增加),伴随着Phos-mTOR和p62蛋白表达的进一步下降。结论:APR3蛋白是一个定位于溶酶体膜的全膜蛋白;APR3蛋白过表达导致细胞增殖活力下降,cyclin D1表达下降和细胞周期阻滞(G1/S期),细胞凋亡与自噬增多,并对Rapamycin的敏感性增加。
【图文】：

通大学博士学位论文 APR3 蛋白的亚细胞学定位及其在细胞凋亡和自噬中信号肽预测利用 expasy 信息分析工具获得信号肽预测效果，如图 1-1 所示。asure Position Value Cutoff signal peptide?x. C 26 0.628x. Y 26 0.700x. S 22 0.876an S 1-25 0.768D 1-25 0.737 0.450 YES=Sequence SP='YES' Cleavage site between pos. 25 and 26: ALA-LP D=0toff=0.450 Networks=SignalP-noTM、结果R3的生物信息学分析

图 1-2. APR3 蛋白跨膜区分析Figure 1-2. Analysis transmembrane region of APR3 protein由图 1-2 分析表明，，APR3 显示有 2 个跨膜区，定位于膜上。其跨膜序于“FSLLMFFGILGSTTLAISILLWG”氨基酸序列中。糖基化分析tput for ' NM_027855.3' NM_027855.3 Length: 223SGGSRAAALLLVLGVERALALPEICTLCPGGMHNLSRVAAYCEDTSKLMQARCCLNQKGTILGLDLQNCSLKDPG 8AYTAIIIDLQANPLKDDLANTFRGFTQLQTLILPQDVPCPGGSNAWDNVTSFKDKQICQGQRDLCNSTGSPEMCP 16ASDGPGLLQCVCADGFHGYKCMRQGSFSLLMFFGILGSTTLAISILLWGTQRRKAKAS.................................N.................................N....... 8...............................................N........................... 16.......................................................... 24shold=0.5)
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2;Q811.4

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 任智;细胞凋亡的研究现状[J];四川师范学院学报(自然科学版);2000年04期

2 罗琦,王建华,王远亮,潘君;金属离子在细胞凋亡中的调控作用[J];重庆大学学报(自然科学版);2003年08期

3 方晓阳,盛伟;细胞凋亡的概念来源及其研究进展[J];生命的化学;2003年02期

4 田辉凯,姚小皓,李学军;非细胞体系在细胞凋亡中的应用[J];生命的化学;2003年02期

5 叶玲玲,陈昭烈;动物细胞大规模培养过程中细胞凋亡的检测与控制[J];中国生物工程杂志;2003年08期

6 龙泉,邢婉丽;Jurkat细胞凋亡的实时电旋转芯片检测[J];生物物理学报;2005年01期

7 杨竹林,伍汉文;细胞凋亡调控因素有关基因的研究[J];国外医学(生理、病理科学与临床分册);1997年02期

8 刘恩梅,杨锡强;细胞凋亡及其影响因素[J];重庆医学;1998年01期

9 金梅林,陈焕春;细胞凋亡及基因调控在兽医病毒学领域研究动态[J];动物医学进展;2000年04期

10 何静妹;细胞的自杀行为——细胞凋亡[J];邯郸医学高等专科学校学报;2000年05期

相关会议论文 前10条

1 陈颖丽;李前忠;;不同亚细胞位置的细胞凋亡蛋白质的结构特性分析[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年

2 孙英丽;赵允;朱山;翟中和;;植物细胞凋亡及其机理的研究[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年

3 刘二龙;袁慧;;锌与细胞凋亡[A];2003全国家畜内科学学术研讨会论文专辑[C];2003年

4 邱洁;高海青;;锌在细胞凋亡中的作用研究进展[A];山东省微量元素科学研究会第三届学术研讨会论文汇编[C];2006年

5 俞雅萍;;细胞凋亡的机制及途径和影响因素[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年

6 于青;袁伟杰;姚建;;晚期糖基化终末产物引起足细胞凋亡的机制[A];2007年浙沪两地肾脏病学术年会资料汇编[C];2007年

7 季宇彬;尹立;汲晨锋;;调控细胞凋亡的线粒体因素[A];肿瘤病因学研究与中西医结合肿瘤综合诊疗交流研讨会论文集[C];2009年

8 吴经纬;汤长发;;运动中细胞凋亡的线粒体变化特征[A];湖南省生理科学会2006年度学术年会论文摘要汇编[C];2007年

9 蒲小平;李长龄;屠鹏飞;宋志宏;;中药肉丛蓉成分抗神经细胞凋亡的实验研究[A];第七届全国生化药理学术讨论会论文摘要集[C];2000年

10 江键;宋诚荣;崔黎丽;方影;王小平;;静电场对细胞凋亡作用的初步探讨[A];中国物理学会第九届静电学术年会论文集[C];2000年

相关重要报纸文章 前10条

1 商东;“细胞凋亡”与临床医学[N];中国医药报;2001年

2 张志军;细胞凋亡与中医药[N];中国医药报;2002年

3 ;“细胞凋亡疗法”正逐步成为治疗癌症的新途径[N];中国高新技术产业导报;2002年

4 记者张建松;治疗癌症新途径：细胞凋亡疗法[N];科技日报;2002年

5 李明辉;“细胞凋亡”治癌症[N];医药导报;2002年

6 洪敏;细胞凋亡研究引人关注[N];中国医药报;2008年

7 陶春祥;细胞凋亡对心脏疾病的影响[N];中国医药报;2003年

8 本报实习记者 梁媛媛;薛定：发现癌症“开关”[N];北京科技报;2010年

9 高书明;诱导癌细胞凋亡[N];中国医药报;2004年

10 勇汇;中药诱导癌细胞凋亡研究进展[N];中国医药报;2002年

相关博士学位论文 前10条

1 杨利;系列多氮类化合物的抗肿瘤活性研究[D];武汉大学;2012年

2 张浩;从分子、细胞和动物水平研究铅诱发氧化损伤及细胞凋亡的效应与机理[D];山东大学;2015年

3 何欣怡;家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）抑制家蚕BmN细胞凋亡的功能研究[D];浙江大学;2015年

4 冯全服;从线粒体途径研究川芎嗪诱导HepG2细胞凋亡效应机制[D];南京中医药大学;2015年

5 张晓倩;高糖诱导Bim蛋白高表达而促肾近曲小管上皮细胞凋亡的机制探讨[D];山东大学;2015年

6 孙健玮;PTEN基因负调控Raf1磷酸化的作用及其对PC3细胞凋亡的影响[D];昆明医科大学;2014年

7 徐林艳;肿瘤细胞凋亡过程中TNFRSF10B和CFLAR调控机制研究[D];山东大学;2015年

8 樊庆端;生物调控网络的建模与动力学行为研究[D];上海大学;2015年

9 王德选;WNK_3对钠氯协调转运子的调节及在胚肾细胞凋亡中的保护作用[D];南方医科大学;2015年

10 叶嘉;Nogo-B在急性肺损伤肺泡上皮细胞凋亡中的作用[D];第二军医大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 曹璐璐;2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)对人胚肾细胞(HEK293)的毒理效应及作用机制研究[D];中国科学院烟台海岸带研究所;2015年

2 张薇;蒜头果蛋白诱导HepG-2细胞凋亡的研究[D];云南民族大学;2015年

3 唐建国;视黄醇X受体出核抑制对神经元细胞凋亡的影响[D];福建医科大学;2015年

4 安璐;3-氯-1,2-丙二醇细胞毒性及其诱导HEK293细胞凋亡途径探究[D];江南大学;2015年

5 杨翔;Procaspase-8的异常表达抑制TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡[D];昆明理工大学;2015年

6 张昌明;I3C通过调控p53泛素化对喉癌Hep-2细胞凋亡的影响[D];延边大学;2015年

7 彭涵;共轭亚油酸对仔猪脂肪细胞凋亡的影响[D];西南大学;2015年

8 李立辉;ΔFosB通过MMP-9调控山羊乳腺上皮细胞凋亡的分子机制[D];西北农林科技大学;2015年

9 杨鑫铖;Hedgehog信号通路在大鼠急性胰腺炎腺泡细胞凋亡中的作用[D];河北医科大学;2015年

10 贾琼琼;MicroRNA-214对H_2O_2损伤L6骨骼肌成肌细胞增殖和凋亡的影响[D];河北医科大学;2015年

本文编号：2594654