清热解毒凉血化瘀法联合骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭模型大鼠及其机制的初步研究

发布时间：2017-03-21 09:04

  本文关键词：清热解毒凉血化瘀法联合骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭模型大鼠及其机制的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定目的:使用全骨髓贴壁培养法筛选大鼠骨髓间充质干细胞,并使用流式细胞技术鉴定其纯度。方法:1.分离大鼠骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁培养,多次传代的方法纯化细胞:(1)取3-5周龄SFP级SD大鼠,剪开腿部皮肤及肌肉组织,无菌环境下取出双侧股骨及胫骨,清理干净附着组织,剪断两端,使用磷酸盐缓冲液冲出骨髓,1200r/min离心4min后弃上清液,加入以L-DMEM+10%胎牛血清配置的培养液吹打混匀,调整细胞密度,种于直径70mm的培养皿中进行培养,每个培养皿接种细胞数约为1*106-7。(2)上一步接种的细胞经48h首次全量更换培养液,以后每48h或72h全量换液,待细胞生长至覆盖皿底面积的70%-80%时,以0.25胰蛋白酶消化后1:2传代,传至第4代备用。2.骨髓间充质干细胞表面标记的流式细胞技术鉴定:取生长状态较好的第4代细胞,胰酶消化,羊血清封闭,洗涤之后相应抗体标记,上流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表达阳性的CD29、CD44以及表达阴性的CD34、CD45。结果:1.成功分离出贴壁生长的细胞,经过传代培养筛选后得到呈梭形或多角形生长,有伪足,旋涡状或火焰状分布的细胞。2.经流式细胞仪鉴定,CD29细胞阳性率达99.2%、CD44细胞阳性率达99.4%,CD34细胞阳性率达4.5%,CD45细胞阳性率达16.9%,符合骨髓间充质干细胞表面标志。结论:采用全骨髓贴壁培养法,经过多次传代能够从SD大鼠骨髓中分离筛选出骨髓间充质干细胞。第二部分:清热解毒凉血化瘀中药联合BMSCs治疗急性肝衰竭模型大鼠机制的初步研究目的:采用清热解毒凉血化瘀中药灌胃联合干细胞移植的方式治疗急性肝衰竭模型大鼠,对比仅采用干细胞移植方法治疗的效果,通过:1.检测血清肝功能、肝损伤相关细胞因子(TNF-α、IL-10)等指标;2.观察肝组织病理切片以及荧光标记的骨髓间充质干细胞在肝内的定植情况;初步研究清热凉血解毒化瘀中药联合干细胞移植治疗肝衰竭的效果和机制。方法:1.骨髓间充质干细胞的荧光标记将第一部分培养得到的骨髓间充质干细胞用胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液,调整浓度后用荧光标记剂CM-Dil标记细胞。2.建立急性肝衰竭模型大鼠取体重约为180g-220g清洁级SD大鼠,腹腔注射1.4g/kg的D-gal N,48h后将仍存活的大鼠随机抽取5只采集血清及肝组织,检测血清肝功能指标并与正常大鼠比较,验证造模成功与否。3.急性肝衰竭大鼠的中药+干细胞联合治疗(1)将存活的急性肝衰竭模型大鼠随机分为4组(A组:中药联合干细胞治疗组;B组:干细胞治疗组;C组:中药治疗组;D组:模型对照组;)分别做以下处理:○1 A、B两组:以1%戊巴比妥钠麻醉,腹部剃毛,消毒、铺巾后于中上腹部作1个约2cm长的纵行切口,经门静脉输入荧光标记的骨髓间充质干细胞,每只大鼠输入细胞数量约为1*106个,输入完毕后逐层关腹,以无菌纱布覆盖。○2 C、D两组大鼠手术处理同前,找到?门静脉后经门静脉输入与A、B组大鼠等体积的用于培养细胞的培养液。(2)手术后第1天起,A组大鼠以茵陈四苓颗粒灌胃,B组大鼠灌服等量蒸馏水,C组大鼠以茵陈四苓颗粒灌胃,D组大鼠灌服等量蒸馏水。所有实验动物自由进食,饲普通块料,饮5%葡萄糖溶液。3.检验标本的采集及检测于治疗7天后所有实验动物麻醉后腹腔动脉采血、采集肝组织,制作肝脏病理切片,观察肝衰竭损伤恢复情况及干细胞定植生长情况,检测血清总胆红素、谷氨酸转氨酶、肿瘤坏死因子-a、白介素-10等指标;通过RT-PCR法检测肝组织白蛋白、甲胎蛋白等指标判断各组实验动物肝功能恢复程度。结果:1.腹腔注射D-氨基半乳糖48h后大鼠急性肝衰竭模型成功建立,60只实验大鼠在24h内死亡9只,48h内共死亡13只,另抽取5只验证造模效果,剩余35只大鼠进入下一步实验。2.各组实验动物行手术后观察7d,模型组大鼠(D组)活动减少,食欲不振,饮水减少,毛发蓬乱,尿色深黄,体重减轻,约5d后开始逐渐恢复;各治疗组大鼠症状表现均较模型组大鼠轻,饮食及活动恢复较早,约3d后开始逐渐恢复。各组大鼠生存情况:○1 A组大鼠手术后1d内死亡1只,2d内共死亡2只;○2 B组大鼠手术后1d内死亡1只,2d内共死亡2只;○3 C组大鼠手术后1d内死亡2只,2d内共死亡2只;○4 D组大鼠手术后1d内死亡2只,2d内共死亡3只,3d内共死亡4只;其余各组大鼠均存活超过7天;3.实验动物血清炎症细胞因子指标检测结果○1采取治疗措施的3组(A、B、C组)大鼠TNF-α水平低于模型对照组(D组),IL-10水平高于模型对照组,差异有统计学意义;○2各治疗组间比较,A组与B、C两组比较,TNF-α水平较其他两组低,IL-10水平较其他两组高,差异有统计学意义,但B组与C组之间差异无统计学意义;4.实验动物血清肝功能指标检测结果○1各个治疗组ALT、TBIL指标相比模型组均有明显改善,差异有统计学意义;○2各个治疗组之间的肝功能指标比较:A组ALT、TBil指标相比B组和C组有明显改善,差异有统计学意义;B组上述指标相对C组有改善,差异有统计学意义。5.肝脏病理切片○1 A组经过BMSCs+中药联合治疗后,炎细胞浸润显著减少,肝小叶结构恢复,静脉周围胆管增生;○2 B组炎症浸润亦显著减少,但汇管区仍有炎症浸润,肝组织结构恢复;○3 C组肝脏结构恢复,但仍有较B组稍多的炎症细胞聚集;○4 D组肝组织结构亦能见到恢复,但是炎症浸润程度较治疗组重;○5荧光显微镜下观察标记的骨髓间充质干细胞:A、B两组在肝组织内可见一定数量被标记的细胞,但占细胞总数中的比例不大。6.各治疗组肝组织ALB、AFP含量的RT-PCR及电泳结果RT-PCR结果显示,三个治疗组均有ALB及AFP的表达,表达强度依次为A组、B组、C组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.腹腔一次性注射1.4g/kg D-Gal N能够成功建立SD大鼠急性肝衰竭模型。2.茵陈四苓颗粒与骨髓间充质干细胞移植均能够减轻急性肝衰竭大鼠肝脏的炎症反应,促进肝功能恢复和肝再生,中药与干细胞联合治疗的效果好于两者单独使用。3.茵陈四苓颗粒与骨髓间充质干细胞在联合治疗急性肝衰竭模型大鼠上有协同作用,可能是通过两者共同调节免疫系统信号通路和对抗细胞凋亡来实现。4.骨髓间充质干细胞输注入急性肝衰竭大鼠肝内可以促进肝再生,使肝组织ALB及AFP表达增高,茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞治疗可以加强这一作用。5.本次实验骨髓间充质干细胞通过门静脉输入肝脏后在肝内见到定植和增殖分化的细胞数不多,除实验操作失误或荧光标记效果不佳之外,可能从一个方面提示:在急性肝衰竭的治疗上,BMSCs短期内发挥的疗效可能不是由其分化为肝细胞而达到促进肝再生及恢复肝功能的效果。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 流式细胞技术 骨髓间充质干细胞 中药 急性肝衰竭 肝再生
【学位授予单位】：四川医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.3;R-332
【目录】：

• 本文英汉缩略词对照表4-5
• 摘要5-12
• ABSTRACT12-18
• 前言18-23
• 第一部分23-32
• 引言23
• 材料与方法23-28
• 结果28-30
• 讨论30-31
• 结论31-32
• 第二部分32-55
• 引言32
• 材料与方法32-39
• 结果39-48
• 讨论48-54
• 结论54-55
• 参考文献55-59
• 综述59-66
• 参考文献63-66

【引证文献】

中国重要会议论文全文数据库 前2条

1 张进;黄进;徐志伟;;补肾填精药促进间充质干细胞增殖的效应及机制研究[A];第六届全国中西医结合基础理论研究学术研讨会暨第二届湖南省中西医结合学会肝病专业学术年会论文集[C];2010年

2 韩海啸;李军祥;孟捷;张厂;;调肝益气通络方药物血清诱导骨髓间充质干细胞转化为肝细胞的研究[A];第二十五届全国中西医结合消化系统疾病学术会议论文集[C];2013年

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本文编号：259365