结核分枝杆菌脂解酶Rv1076（LipU）促进细菌生存及宿主细胞因子的表达

发布时间：2020-03-22 19:43

【摘要】：结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌复合菌群感染所导致的一种人畜共患病,严重威胁着人类健康,是世界性的公共卫生难题。据世界卫生组织(WHO)报道,近年来结核病“死灰复燃”,全世界约三分之一的人为结核分枝杆菌潜伏感染者,每年新增感染者上千万,死亡人数高达数百万。中国是全球第三大结核病高负担国家,感染人数、患病人数和死亡人数均高于全球平均水平。近年来,耐多药(Multidrug-resistant tuberculosis,MDR)、广泛耐药(Extensively drug-resistant tuberculosis,XDR)以及HIV共感染等问题的出现与扩散更加剧了结核病的严峻形势。分枝杆菌细胞壁含有大量脂质,约占细胞干重的30~40%,但它们的生物功能、合成途径及其错综复杂的结构仍然是个谜。研究表明,在感染过程中,结核分枝杆菌可积累大量的脂质(包括来自宿主细胞的脂类),并以三酰甘油(TAG)形式储存起来,以维持细菌生存。处于非复制阶段的结核分枝杆菌可在宿主细胞内持续存活几十年,尤其难以消灭。在重新激活的情况下,TAG被用作能量来刺激细胞恢复到复制状态,从而导致活性感染。结核分枝杆菌基因组中有大量的基因编码脂质代谢相关的酶类(约250个),其中,脂解酶可水解细菌储存的脂质,为结核分枝杆菌生存提供能量。这些酶主要分为五大家族:Lip家族、磷脂酶家族、角质酶家族、β-内酰胺酶家族和PE/PPE家族。它们在分枝杆菌的生命周期、持留和毒力中发挥着关键作用。深入研究这些酶的特性与功能,将有助于开发新型抗结核药物和诊断试剂。本课题以结核分枝杆菌H37Rv中Lip家族成员Rv1076(LipU)为研究对象,深入探索了LipU的酶学特性及功能。基于LipU与激素敏感型家族脂酶(HSL)一样,都具有保守的五肽模序“GXSXG”而被注释为脂酶/酯酶。为了确定Rv1076的酶学特性及功能,我们对该蛋白进行了表达纯化,并测定其活性、酶学特性及酶学动力学参数;然后通过定点突变来验证LipU的活性位点残基。同时,将其在耻垢分枝杆菌中的同源基因进行了敲除,以探索LipU的功能;通过细胞因子检测来揭示LipU在宿主免疫应答中的作用。实验结果发现,LipU对短链的对硝基苯酚酯具有高度的催化活性,其最适温度和pH分别为40℃、pH 8.0。LipU的酶活、Km和Vmax值分别为176.7 U/mg,1.73μM和62.24μM/min;离子型表面活性剂对LipU的活性影响较大;将其活性位点Ser140,Asp244和His269突变后,酶活几乎完全丧失。Rv1076在饥饿处理下显著上调;将该基因敲除后,耻垢分枝杆菌对碳源的利用能力降低,表明LipU对于结核分枝杆菌在胁迫条件下的生存具有关键作用。我们将重组蛋白rLipU与巨噬细胞THP-1共孵育后,检测到细胞因子TNF-α和IL-12显著上调,由此表明,LipU参与了宿主免疫应答,具有良好的免疫原性。本研究详细地阐释了结核分枝杆菌LipU的特性与功能,有助于提高大家对Lip家族的认识,并且为其他脂酶的研究提供了参考,为开发新型抗结核病药物和诊断试剂提供新思路。
【图文】：

结核分枝杆菌,基因功能

第 1 章综述多态性串联重复序列）[18, 19]，并且发现它们对应于 PE 和 PPE 家族 3′端的部分序列，从而诞生了 PE/PPE 超家族（包含 PE-PGRS、PE-MPTR、PE 和 PPE 四个亚家族）。该家族成员大部分为分泌蛋白，在免疫逃逸、抗原变异和致病性方面发挥着重要作用，是疫苗和诊断试剂理想的候选分子。结核分枝杆菌与其他细菌的根本区别还在于，，Mtb 很大一部分基因组被用来编码脂肪合成和分解的酶，如图 1-1所示，预计有 250 多个参与脂肪酸代谢的酶类[15]，其数目是大肠杆菌的 3 倍。在结核分枝杆菌感染过程中，这些酶可能参与宿主脂质的水解，从而为细菌提供能量，维持 Mtb 在胞内的存活。因此，抑制这些酶的活性是干预性治疗和免疫调节的良好策略[20]。

氨基酸序列,脂酶,催化作用

图 1-2 脂酶的催化作用Fig. 1-2 The catalytic action of lipases.广泛分布于自然界中，最早发现于 1834 年，迄今已有一百多年，已发现有多种生物包括植物、动物和微生物都可以产生脂酶酶由于具有以下特征而被广泛应用于工业生产和生物医学领域用一般不需要辅酶因子参与[32]；2）在有机溶剂中十分稳定；特异性；4）高度的异构体选择性[33]。根据氨基酸序列的相似可分为 8 个家族（I-VIII），它们的来源与特征如下表所示。表 1-1 微生物脂酶分类Table 1-1 Families of bacterial lipolytic enzymes主要来源特征描述绿脓假单胞菌荚壳伯克霍尔德氏菌荧光假单胞菌枯草芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌等又称为“True Lipase”，是由传统意义上的假单胞菌属脂酶，因为它是第一个被研究并在工业中占优Lipase 而得名。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378.911

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