mTORC1对HES1蛋白稳定性的调控作用及其机制研究

发布时间：2020-03-23 09:46

【摘要】：研究背景及目的:mTORC1是一种含有mTOR蛋白激酶且对雷帕霉素敏感的蛋白激酶复合体,是mTOR信号通路的关键组成之一,其整合营养(如氨基酸)、能量、生长因子(如胰岛素)等多种信号,在细胞生长、细胞周期、生物合成代谢、自噬等众多生物学过程发挥重要作用。而Notch信号通路是一条经典的信号通路,其可以通过相邻细胞之间的相互作用调节细胞、组织、器官的分化和发育,Notch信号的异常激活也与众多肿瘤的发生密切相关。近年来,已有许多研究证明了mTORC1和Notch信号通路之间存在密切关联,但其具体机制尚不完全清楚。研究两者间的关系不仅可以为细胞的增殖分化以及干性研究等提供新的研究方向,而且可以为肿瘤防治提供新的药物作用靶点,具有重要的理论价值和应用价值。我们的研究发现m TORC1对Notch信号通路特异性转录因子HES1的蛋白表达水平具有调控作用。本研究旨在揭示mTORC1对HES1蛋白表达水平调控的分子机制。研究方法:(1)利用免疫印迹法(Immunoblot)对比研究细胞在mTORC1不同激活状态下Notch信号通路主要分子的蛋白质表达水平。(2)利用mTORC1特异性抑制剂、蛋白合成抑制剂、蛋白酶体抑制剂以及RT-PCR、免疫印迹等技术阐明mTORC1究竟是通过调控HES1 mRNA转录、蛋白质合成还是蛋白质降解的机制对HES1蛋白表达水平进行调控的。(3)利用Cullin Neddylation抑制剂、Cullin1 shRNA静默、Dominant negative Cullin突变体等研究方法,研究Cullin1依赖性E3泛素连接酶对HES1蛋白稳定性的调控作用。(4)利用一系列蛋白激酶抑制剂与雷帕霉素的联合应用,初步揭示GSK3在mTORC1抑制状态下HES1降解的作用,进而利用Constitutively active GSK3β与HES1共转染以及GSK3βshRNA干扰等方法,进一步研究GSK3在mTORC1抑制状态下对HES1降解的调控作用。(5)采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)方法研究识别并降解GSK3磷酸化底物的E3泛素连接酶FBWX7与HES1是否存在结合。(6)利用DNA定点突变技术对HES1潜在的GSK3磷酸化位点进行突变,研究各个HES1突变体在mTORC1抑制状态下的蛋白稳定性,从而初步揭示GSK3的磷酸化位点,为揭示FBWX7在mTORC1抑制状态下降解HES1提供了Phosphodegron的结构基础。研究结果:(1)mTORC1调控Notch信号下游的靶基因HES1的蛋白表达水平,且其调控水平与基因水平无关而与蛋白质降解水平相关。(2)mTORC1通过调控HES1蛋白降解的机制对HES1蛋白表达水平进行调控。在mTORC1激活状态下,它维持HES1的蛋白稳定性;而在mTORC1抑制状态下,HES1被迅速降解。(3)在m TORC1抑制状态下,泛素化-蛋白酶体介导了HES1蛋白的降解,而Cullin1依赖性E3泛素连接酶对HES1蛋白稳定性具有调控作用。(4)GSK3β在mTORC1抑制状态下对HES1降解产生调控作用,GSK3可能是mTORC1抑制状态下对HES1产生Phosphodegron的重要激酶。(5)识别并降解GSK3磷酸化底物的E3泛素连接酶FBWX7与HES1存在结合。(6)HES1 S101和S105可能是潜在的磷酸化位点,这两个位点的丙氨酸突变导致mTORC1抑制状态下HES1蛋白质稳定性的提高。研究结论:mTOR信号通路对Noch信号通路的调控机制仍不甚明了。本研究发现在mTORC1活性抑制状态下,Notch信号通路下游重要靶基因HES1的蛋白的表达量显著下降。mTORC1调控HES1蛋白稳定性是通过Cullin1依赖性E3泛素连接酶实现的。进一步研究发现GSK3β可能是mTORC1抑制状态下磷酸化HES1,负责产生Phosphodegron的蛋白激酶,而FBXW7与HES1存在物理结合,HES1S101和S105可能是潜在的磷酸化位点,可能是由FBXW7识别并降解的位点。本研究揭示了mTORC1调控Notch/HES1信号通路的全新机制,具有重要的理论价值和潜在的应用价值。
【图文】：

信号相关,蛋白表达,雷帕霉素,信号通路

究 mTORC1 对 Notch 信号通路的调控机制，我们参照各大文献，和 TSC2-/- MEF 细胞中于不同时间点加入雷帕霉素，并利t 的方法比较了 Notch 信号通路主要分子的蛋白质表达水平，检理不同时间点后各分子表达水平的变化。基因敲除的 TSC2-/- MEF 其 mTORC1 高度激活，如图 1A 中 P70比所示。雷帕霉素处理不同时间点后，mTORC1 活性均受到抑制通路相关的 Notch1 蛋白和 Numb 蛋白的变化并不显著。然而，N游靶蛋白 HES1 的表达水平却显著下降，甚至在 6h 的时间点中 H水平也显著降低，，由此，我们初步推断 mTORC1 有可能调控了 H。ch1ycin0 h 6h 12h 24h 48h 0 h 6h 12h 24h 48hTSC2+/+ MEF TSC2-/- MEF

蛋白表达,雷帕霉素,表达水平

江苏大学硕士学位论文我们又利用 TSC1+/+和 TSC1-/- MEF 重复了上述实验，也得到（如图 1B 所示），HES1 蛋白的表达水平不仅在 TSC1-/- 细且雷帕霉素处理显著降低 HES1 的表达水平，由此，我们进一控了 HES1 蛋白的表达。h1TSC1-/- MEFycin 0 h 6h 12h 24h 48h0 h 6h 12h 24h 48hTSC1+/+ MEF
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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