采用蛋白质组学结合高通量测序技术分离和鉴定抗CD47纳米抗体

发布时间：2020-03-23 11:58

【摘要】：CD47属于免疫球蛋白超家族成员之一,在多种肿瘤细胞表面高表达,CD47通过结合巨噬细胞表面的SIRPα并发出“别吃我”信号从而促使肿瘤细胞逃避巨噬细胞吞噬作用。同时,CD47在活化T淋巴细胞中高表达,其能与血小板反应蛋白1(TEP 1)结合,抑制T淋巴细胞的增殖与活化,进而影响T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。因此抗CD47单克隆抗体可以作为肿瘤免疫治疗中的一种新疗法。而纳米抗体是一种源于骆驼可变区的单域抗体,它是目前分子量最小且具有完全抗原结合功能的单域抗体,因此其在药物开发中具有巨大的潜力同时可以作为研究症断的高亲和试剂。本实验利用高通量测序技术和质谱技术联用获得抗CD47骆驼纳米抗体并检测抗体的亲和力,探索蛋白组学技术和基因组学技术在发现和鉴定过程中的价值。本研究内容主要包括以下三个方面:1骆驼免疫抗体库的高通量测序分析以及纳米抗体数据库的建立首先诱导表达以及纯化BL21-pET30a-CD47的原核重组蛋白CD47并免疫新疆双峰驼六次,通过间接ELISA方法测定第五次和第六次免疫血清中抗CD47抗体的滴度,分离全血中外周淋巴细胞,提取总RNA,反转录成cDNA,通过巢式PCR扩增骆驼VHH基因,并将扩增的VHH基因进行高通量测序,使用AbMining ToolBox分析高通量测序数据,利用Python去除数据库中的终止密码子并建立抗CD47纳米抗体氨基酸数据库。间接ELISA测定第六次免疫血清抗CD47抗体滴度为1:384 000,说明抗原CD47在骆驼体内激起了免疫反应,以cDNA为模板通过巢式PCR成功扩增VHH基因,利用高通量测序平台Illumina HiSeq共获得1 054 550条原始基因序列,去除接头序列和低质量序列后共获得序列945 061条,其中有效读长的核苷酸序列主要分布在300-350 nt,碱基质量大于20占总序列的97.67%,碱基质量大于30占总序列的95.58%。获得抗CD47纳米抗体氨基酸数据库为9.19×10~5。经AbMining ToolBox分析高通量测序数据,得到160 485条特异性的CDR3序列,其氨基酸长度主要分布8-35,分析CDR3肽段等电点的主要分布,其中pI 8-9和4-5分别占22.72%和20.1%。2骆驼免疫血清中抗CD47特异性抗体的制备和鉴定首先利用ProteinA对骆驼血清中IgG进行亲和纯化,并通过间接ELISA和Western Blot测定IgG与原核重组蛋白CD47的结合活性,之后将CD47蛋白与CNBr琼脂糖树脂偶联来捕获抗CD47特异性抗体,并测定CD47-CNBr偶联效率,最后通过ELISA和Western Blot检测抗CD47特异性抗体与原核CD47抗原的结合活性,除此之外分别验证血清,IgG和抗CD47特异性抗体与真核CD47和EC9706细胞的结合活性,从而为后续质谱鉴定获得一株能用于治疗的抗体提供实验基础。实验结果显示,利用ProteinA从血清中纯化的IgG经间接ELISA和Western Blot测定表明,当IgG稀释1:256 000仍然与原核表达的CD47蛋白仍具有良好的结合活性。经15%SDS-PAGE显示CD47蛋白成功偶联于CNBr琼脂糖树脂并测定偶联效率为67.8%,间接ELISA筛选纯化抗CD47特异性抗体的洗脱液为pH 2.4的Gly-HCl,利用该洗脱液成功从CD47-CNBr琼脂糖树脂免疫亲和纯化出抗CD47特异性抗体。经间接ELISA和Western Blot验证抗CD47特异性抗体与原核CD47具有高结合活性和特异性。通过ELISA验证血清,IgG和抗CD47特异性抗体与真核CD47的结合情况显示,血清、Ig G与真核CD47蛋白和EC9706细胞有结合活性,相反,抗CD47特异性抗体与真核CD47和细胞无结合。3重链抗体的质谱分析以及抗CD47纳米抗体制备和鉴定首先对ProteinA免疫亲和层析分离的IgG经15%SDS-PAGE分离并切下其亚型重链抗体IgG2和IgG3再进行LC MS/MS鉴定,利用Mascot检索软件将质谱数据与骆驼纳米抗体氨基酸数据库匹配,并将匹配得分最高的3条序列克隆表达,利用间接ELISA测序其与原核CD47蛋白结合,从中挑选结合活性最高的抗CD47纳米抗体并验证该纳米抗体与真核CD47的结合,同时将噬菌体展示技术筛选获得的高亲和力抗体序列分别与质谱数据和高通量数据进行匹配。实验结果显示,3个重组质粒经诱导表达,其中除VHH-410994蛋白不表达外,其余2个蛋白VHH-437310、VHH-737446均表达,其大小在20 kD左右。经间接ELISA表明VHH-737446与原核CD47具有结合活性但与真核CD47不结合。噬菌体展示技术筛选获得的抗体序列仅能与高通量数据库成功匹配获得6个序列且在数据库中低频出现。
【图文】：

注:A: M: 非预染 Marker (14.4~116.0 kDa); 1 : 纯化的 CD47 蛋白; B ;M:预染 Marker(14~120.0 kDa); 2-1 A: 15%SDS-PAGE 检测 CD47 粗蛋白的纯化 B: Western Blot 检测 CD47 重组蛋白的表达ote: B: M: unstained protein molecular weight marker (14.4-116.0 kDa); 1: purification proteinof CD47 (14-120 kDa); B: M: prestained protein molecular weight marker; 1: Recombinantprotein CD47gure .2-1 A: analysis of purification of CD47 by 15% SDS-PAGE B: analysis of the expressionof CD47 recombinant protein by Western Blot2 抗原 CD47 免疫新疆双峰驼血清效价测定将纯化的 1mg CD7 蛋白免疫新疆双峰驼，在用 CD47 初次免疫新疆双峰驼采集免疫前外周淋巴血，并收集血清，，冻存于-80 ℃，初次免疫两周后以后每一周将抗原 CD47 与不完全弗氏佐剂等体积混合，抗原免疫量 1mg/次，在免

图 2-2 间接 ELISA 测定 CD47 第五次（A）和第六次(B)免疫骆驼血清抗体效价Fig.2-2 Determination of the anti-CD47 serum titers after the fifth (A) and sixth immunization (B)by indirect ELISA3.3 骆驼外周淋巴细胞 RNA 的提取以及 VHH 片段的获得
【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 周秉博;郝胜菊;闫有圣;冯喧;刘芙蓉;蒋小慧;;高通量测序技术在常见遗传性疾病中的应用进展[J];中国优生与遗传杂志;2017年11期

本文编号：2596689