柯萨奇病毒B5冷适应减毒活疫苗的研究

发布时间：2020-03-24 21:22

【摘要】：柯萨奇病毒B组5型(Coxsakievirus B5,CVB5)是引起5岁以下婴幼儿发病的一种肠道病毒,轻则能够造成婴幼儿的手足口病、腹泻,重则可引起无菌性脑膜炎、心肌炎、I型糖尿病等并发症,对全球范围的婴幼儿的健康造成了不可估量的威胁。然而,目前并未有有效的治疗手段,更没有疫苗来预防CVB5的感染,因此,CVB5疫苗的研发刻不容缓。本研究的目的是通过冷适应减毒的方法制备CVB5减毒疫苗,通过动物实验对其安全性和有效性进行评价。为了获得CVB5温度敏感株,我们通过冷适应减毒的方法进行,方法如下:将本实验室冻存的CVB5病毒液过滤除菌后接种于Vero细胞中,37℃培养1代,即为野毒株,命名JZ-WT;33℃传至50代,即为温度敏感株,命名JZ-P50。其中,每10代分别测定33℃和37℃病毒滴度,通过其不同代次不同温度之间的滴度比较来判定是否为温度敏感株。JZ-P50温度敏感株通过制备疫苗来评价其安全性和有效性,方法为将CVB5病毒液纯化、过滤除菌、分装。安全性的评价是通过对动物的临床特征,比如,幼鼠的体重变化,是否瘦弱、弓背、瘫痪、死亡等体征变化,以及幼鼠个体、器官和病理切片观察等方面进行的。而对其有效性评价则是通过免疫原性和保护力两个方面进行的。免疫原性是测定小鼠血清的总抗体和中和抗体来反映,保护力是通过被动免疫母鼠对其幼鼠的体重和死亡情况来进行评价。最后,通过对其基因组的测序,碱基和氨基酸序列的分析来进一步确定CVB5减毒活疫苗的分子机制。CVB5温度敏感株的筛选结果显示,(1)从20代开始,CVB5病毒逐渐适应33℃低温环境,而对37℃的适应能力降低。说明该病毒在33℃下适应成功;(2)从40代到50代,33℃/37℃的滴度比值大于100倍,则说明从40代开始该病毒已成为温度敏感型。(3)从接种在Vero细胞、Hela细胞、KMB17细胞中的病变情况可以看出,CVB5最适合生长的细胞基质是Vero细胞。通过动物实验对CVB5温度敏感株安全性评价的结果,(1)按三种剂量注射,野毒JZ-WT组在10~6TCID50时体重逐渐下降,而阴性对照与JZ-P50体重变化趋势持续上升差异不大。(2)从临床指标和脏器重量以及器官来看,阴性对照与JZ-P50组明显比野毒JZ-WT组高。(3)而从组织病理切片中观察,JZ-P50组织未出现损伤。综合上述结果,初步认为CVB5毒株是减毒的。有效性评价结果显示,(1)三次免疫小鼠的血清总抗体效价为1:500,中和抗体效价为1:10,单次免疫的小鼠血清总抗体效价为1:50,中和抗体未检测出来。(2)被动免疫母鼠检测保护力,发现免疫减毒株组母鼠出生的幼鼠被野毒株攻毒后全部存活,而免疫PBS组母鼠出生后的幼鼠被野毒株攻毒后到11天全部死亡。这证明该减毒株对小鼠具有很好的保护效力。冷适应传代株的基因组测序表明,碱基和氨基酸的许多位点突变都涉及了CVB5毒株的温度敏感性和减毒,这些突变位点包括碱基的C106T、T664C、A754T、T800C、A1322G、G1514T、T1515G、G1517A、T1519C、C2821A、A2827T、T2870C、G3133A、G3543A、A3574G、A3672G、T4476A、G6592A,氨基酸的Q4L、Q257H、W258G、I259T、T693N、E695V、G797D、E934K、K944R、M977V、S1245T、G1950E。本实验初步对CVB5冷适应减毒活疫苗进行研究,并进一步的证实CVB5毒株是冷适应株、温度敏感株且具有安全性和有效性,为后期疫苗的中试及大规模培养奠定了基础。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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