海马CA1区特异性敲除FGF13对小鼠行为学的影响及机制的研究

发布时间：2020-03-25 02:23

【摘要】：众所周知,大脑功能的完整在整个机体生长发育过程中起着至关重要的作用,而大脑的功能与可塑性依赖于在神经系统发育过程中建立的复杂的神经回路。神经系统发育的异常不仅可引起多种神经系统疾病,如自闭症、癫痫、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑共济失调、智力发育缺陷、神经炎性痛等,与此同时,还会影响其他多系统的发育异常及功能障碍,如神经内分泌功能障碍等。近年来研究表明,遗传性X染色体连锁智力发育缺陷综合征(X-linked mental retardation,XLMR)与神经系统的发育障碍有关。有趣的是,研究者发现成纤维细胞生长因子13(Fibroblast growth factor 13,FGF13)在这一遗传性疾病中发挥着重要的功能。因此,FGF13在遗传性X染色体连锁智力发育缺陷综合征这一疾病中的作用被广泛关注。成纤维细胞生长因子同源性因子(Fibroblast growth factor homologous factors,FHFs)家族属于成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors,FGFs)家族成员,其成员包括FGF11-FGF14。FHFs与FGFs具有30%-50%的氨基酸序列同源性,但由于其N-末端缺少分泌信号序列而不能分泌到细胞外,也不能与FGF受体结合,因而FHFs可能在细胞内发挥与FGFs不同的重要作用。近年来,有关FHFs在神经系统中发挥的作用受到广泛关注。研究表明,FGF12与FGF14的缺陷通过介导电压依赖性钠通道(Voltage-Gated Sodium Channels,VGSCs)和电压依赖性钙通道(Voltage-Gated Calcium Channels,VGCCs)的异常使得小鼠发生严重的共济失调;FGF12通过调节血管平滑肌的表型转化影响血管的舒缩功能;FGF13通过影响神经元的发育和迁移,在遗传性X染色体连锁智力发育缺陷综合征中发挥着重要的作用。研究者发现,FGF13的缺陷引起海马神经元的迁移障碍,轴突末端出现多极化现象。另外,谷氨酸受体在海马神经元中高表达,其功能与学习记忆有着密切的关系。依赖于谷氨酸受体的开放所产生的长时程增强(Long-term potentiation,LTP)被认为是学习记忆行为的机制。然而,FGF13在XLMR疾病中所发挥的电生理机制及其与谷氨酸受体间的联系还并不清楚。因此,我们拟在完成海马CA1区特异性敲除小鼠的构建及行为学评价后,试图通过FGF13对海马神经元电生理特性及谷氨酸受体的调节作用进一步探究其对XLMR的机制。第一部分海马CA1区特异性敲除FGF13小鼠的构建及行为学的变化目的:使用Cre-loxP重组酶系统特异性敲除海马CA1区神经元中的FGF13,研究海马CA1区神经元FGF13缺陷对动物行为学的影响。方法:(1)CamKⅡ-Cre小鼠与FGF13-loxP小鼠交配繁殖及基因型鉴定,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时定量PCR(qPCR)鉴定海马组织中FGF13敲除效率。(2)应用Morris水迷宫(Morris Water Maze),旷场实验(Open-field Test),高架十字迷宫(Elevated Plus Maze)测定野生型(Wild type,WT),FGF13敲除小鼠(Knock out,KO)的空间记忆、焦虑及抑郁样行为。(3)统计方法:两样本t检验、单因素方差分析。结果:(1)转基因小鼠交配繁殖及基因型鉴定:将CamKⅡ-Cre转基因小鼠与FGF13~(fl/fl)转基因小鼠交配得到CamKⅡ-Cre,FG13~(fl/+)杂合子小鼠后,再与CamKⅡ-Cre,FGF13~(fl/+)杂合子小鼠交配得到CamKⅡ-Cre,FGF13~(fl/fl)小鼠,即海马CA1区神经元特异性敲除FGF13的转基因小鼠。小鼠新出生后10天左右,用剪脚趾标记的方法编号并剪鼠尾约0.5cm提取基因组DNA,通过PCR扩增和凝胶电泳检测目的DNA条带。CamKⅡ-Cre基因的目的条带约100bp,FGF13的WT条带约183 bp,FGF13的Flox条带(FGF13插入loxP位点的目的条带)约241 bp。(2)海马神经元FGF13的敲除效率:通过实时定量PCR技术,对WT组与KO组FGF13的mRNA表达进行定量。结果表明FGF13在WT组小鼠海马神经元中有较高水平表达,相比于WT组,KO组小鼠海马神经元中FGF13的表达量显著降低。(3)行为学结果:与WT组小鼠相比,KO组小鼠在水迷宫中表现出明显的空间学习记忆能力降低,表现为逃逸潜伏期明显升高,平台穿越次数、目标象限停留时间百分比明显下降(P0.05),但在旷场实验及高架十字迷宫实验中,中心活动时间百分比、进入中心区域的次数,开臂与闭臂的比值没有显著性差异。结论:FGF13在海马神经元参与的空间学习记忆行为中发挥重要的作用。特异性敲除海马CA1区神经元中的FGF13能够显著降低小鼠的空间学习记忆能力,但并不影响小鼠的焦虑及抑郁样行为。第二部分FGF13对海马CA1区神经元兴奋性的影响目的:应用脑片膜片钳技术研究FGF13对海马CA1区神经元兴奋性的作用,探究FGF13对学习记忆能力影响的电生理机制。方法:(1)应用脑片膜片钳技术观察FGF13对海马CA1区神经元兴奋性的调节作用,如动作电位。(2)应用qPCR技术研究FGF13对海马神经元中谷氨酸受体表达量的影响。(3)统计方法:两样本t检验和单因素方差分析。结果:(1)通过Step和Ramp两种刺激程序对海马CA1区神经元动作电位的发放频率进行分析,结果提示:与WT组相比,KO组在两种刺激程序下的动作电位发放频率显著降低(P0.05),首次诱发动作电位所需的电流阈值显著升高(P0.05),静息膜电位水平无显著差异。(2)FGF13对海马神经谷氨酸受体表达量的影响:与WT组相比,构成N-甲基-天冬门氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)的必须亚基GluN1亚基在KO组小鼠中显著减低(P0.05),与之相反的是,α-氨基羟甲基异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methy,AMPA)的亚基GluA1、GluA3在KO组小鼠中显著升高(P0.05)。结论:FGF13的缺陷可以显著降低动作电位的发放频率,并降低NMDA受体必须亚基GluN1的表达,升高AMPA受体亚基GluA1、GluA3的表达。
【图文】：

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图 1 海马 CA1 区特异性 FGF13 敲除鼠的构建及敲除效率的检测Fig.1 Generation of hippocampal CA1-specific knock out FGF13 mice usingCre-Loxp recombination system(A) A schematic diagram of FGF13 conditional knock out mice. (B) ThePCR images are shown. (C) qPCR analysis to detect the FGF13 mRNA levelin WT and KO mice. (D) qPCR analysis to detect the FGF12A, FGF12B,FGF14A, FGF14B mRNAlevel. (n=4 for WT and KO，*** P ＜ 0.001）

学习记忆能力

图 2 FGF13 对学习记忆能力的影响Fig.2 Effects of FGF13 in learning and memory(A) The average time needed to locate the platform during the trainingsessions. (B) Swimming paths of WT (left) and KO (right) mice during theprobe trial session in the water Morris maze. (C) Target crossing times. (D)Quadrant preference of mice during the 1 min. (E) Swimming speed of WTand KO mice. (n=13 for WT and KO，* P ＜ 0.05，，** P ＜ 0.01）
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R338

【参考文献】