针刺对HIBD模型脑组织中Beclin-1、P62表达的影响

发布时间：2020-03-25 09:03

【摘要】：新生儿缺氧缺血性脑病是常见的新生儿颅脑性损伤之一,由于围生期窒息、缺氧所引起的脑缺氧缺血性损害。目前对HIBD的发病机制尚不明确,临床上尚无完整统一的治疗方案。而中医药在治疗儿童脑病方面有了突破性的进展,特别是针刺疗法,在治疗HIE后遗症方面,疗效显著。目的:“靳三针头穴”(脑三针、颞三针、智三针)临床治疗儿童脑病包括精神发育迟滞、自闭症、注意力缺陷、多动症等30余年,疗效肯定,而针刺对HIE的机制研究尚未明确,故深入研究针刺治疗HIE的机制是十分必要的。近年来,自噬是研究神经系统性疾病的新方向,许多研究提示在机体发生缺氧缺血性损伤亦有线粒体自噬的存在,线粒体自噬作为一种自我保护机制被发现可以改善HIE脑组织病理变化。前期实验发现,针刺可促进HIBD模型幼鼠自噬相关蛋白Beclin-1,LC3的表达,同时由研究表明,针刺可通过提高BNIP3蛋白水平诱导线粒体自噬的表达。而本实验沿用前期实验缺氧缺血性脑损伤宫内窘迫新生大鼠的模型,提高了新生大鼠的存活率,保证该模型下制备的HIBD大鼠缺氧缺血程度的一致性,研究针刺在加入雷帕霉素、3-MA自噬完全被抑制和过分激活下的作用情况,表明针刺对线粒体自噬的促进作用在针刺修复神经元中的重要程度。方法:通过模拟人类围生期宫内窘迫而延迟剖宫产术的造模方法构建宫内窘迫HIBD大鼠模型。设置模型组,针刺组,激活剂组,抑制剂组,针刺加激活剂组,针刺加抑制剂组,于新生大鼠出生后第14天,开始腹腔注射雷帕霉素、3-MA及针刺干预,针刺组、针刺及激活剂组、针刺加抑制剂组每天针刺干预,模型组、激活剂组、激活剂组针刺组等其他2组干预时进行空抓对照;激活剂组、抑制剂组、针刺加激活剂组及针刺加抑制剂组每天腹腔注射相应的溶液,模型组及针刺组每天腹腔注射生理盐水。干预14天结束后,即是大鼠出生后28天为取材时间点,并采用HE染色观察各组中脑组织形态的改变,Western Blot检测各样本中自噬相关蛋白Beclin-1,P62的含量,并用透射电镜检测观察自噬体的结构。结果:1、HE染色HE染色结果示模型组大鼠全脑细胞组织结构排列稍紊乱,细胞间隙变宽。针刺组:组织细胞排列较紧凑,坏死细胞减少,一些神经元形态接近正常。激活剂组:细胞间隙稍大,神经细胞排列略紊乱,但程度较模型组明显减轻。抑制剂组:细胞层数减少,神经元核固缩深染,细胞排列分散,大脑全层未见到正常形态的神经元。针刺加激活剂组:组织细胞排列相对紧凑,可见一些结构紊乱的细胞。针刺加抑制剂组:大鼠神经元细胞形态不规则,细胞排列分散。2、Western Blot检测结果Beclin-1表达结果:与模型组相比,针刺组Beclin-1蛋白含量升高,差异有统计学意义(P0.05),表明针刺可促进自噬相关蛋白Beclin-1的表达;与模型组相比,激活剂组Beclin-1的表达效果无差异。抑制剂组Beclin-1的表达显著,降低差异有统计学意义(P0.05),说明抑制剂可有效抑制Beclin-1的表达,抑制自噬;与激活剂相比,针刺加激活剂组Beclin-1表达显著升高,说明针刺可显著促进Beclin-1的表达;P62表达的结果:与模型组相比,针刺组P62表达降低,差异有统计学意义(P0.05)表明针刺可促进自噬,而P62是一个自噬负反馈的指标,自噬越高,含量越低;与模型组相比,激活剂组自噬水平上调而使P62含量降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,抑制剂组P62表达升高,差异有统计学意义(P0.05)。3、透射电镜观察各组自噬体结果模型组神经元细胞核边缘稍规则,自噬小体偶见;针刺组神经元细胞,核大正圆,可见细胞周围空泡状的自噬溶酶体;激活剂组神经元细胞边缘规则,可见散在自噬体,自噬体数量相较于模型组增加;抑制剂组可见神经元细胞边缘不规则,与周边组织边界不清,几乎没有自噬小体;针刺加激活剂组神经元细胞边缘规则,核大正圆,可见自噬小体;针刺加抑制剂组神经元细胞边缘不规则,未见自噬小体。结论:(1)本课题沿用前期实验钳夹双侧子宫动脉造成宫内窘迫新生大鼠的模型,保证HIBD模型制备的一致性。(2)采用自噬激活剂(雷帕霉素)及抑制剂(3-MA)、靳三针头穴干预HIBD新生大鼠,在自噬过度激活和抑制情况下,针刺干预脑组织中的自噬相关蛋白Beclin-1,P62有不同的表达。(3)从透射电镜观察自噬小体的结果看,针刺可以促进HIBD大鼠脑组织的线粒体自噬小体表达增加。
【图文】：

技术路线图2.2.1.2机制图
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R245;R-332

【参考文献】

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本文编号：2599700