鲎凝集素促进溶瘤痘苗病毒复制抑制裸鼠肝癌移植模型的生长

发布时间：2020-03-26 08:16

【摘要】：肝癌(Hepatic carcinoma)是发病率较高的一类癌症,调查表明肝癌目前在我国的死亡率仅次于肺癌与胃癌,严重威胁人类的健康。由于肝癌的诱发因素比较多,并且肝癌发展速度较快,预后较差,术后容易复发或转移,所以肝癌发病机制和治疗的研究是目前医学研究中较为严峻的挑战。随着分子生物学和基因工程技术的发展,靶向基因—病毒联合治疗已成为肝癌治疗研究的新导向。本课题以靶向基因—病毒联合治疗为背景,构建携带海洋凝集素基因的重组溶瘤痘苗病毒,研究其对肝癌MHCC97-H细胞裸鼠皮下移植模型的治疗作用。我们选用海洋生物鲎的凝集素(Tachypleus tridentatus lectin,TTL),它是一种脂多糖结合凝集素,能够阻断动物机体内由脂多糖产生的炎症反应。选用的载体是溶瘤痘苗病毒,溶瘤痘苗病毒具有诱导肿瘤细胞特异性裂解的能力,并通过血管关闭间接影响肿瘤生长。溶瘤痘苗病毒在全身施用后具有与淋巴细胞结合的天然能力,但为了逃避抗体和免疫系统的其他组分,治疗剂量必须非常高。我们结合外源基因与痘苗病毒载体各自的优势,以溶瘤痘苗病毒为载体构建重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-TTL,研究其对肝癌细胞的杀伤作用。我们通过TCID_(50)实验分析TTL基因对溶瘤痘苗病毒复制能力的影响,结果显示oncoVV-TTL与对照病毒oncoVV分别感染肝癌细36h之后,oncoVV-TTL的复制能力显著高于oncoVV。接着我们采用肝癌细胞MHCC97-H构建裸鼠肝癌皮下移植模型,在荷瘤体积达到120mm~3时均匀的分成三组,分别设为PBS组、oncoVV组、oncoVV-TTL组。然后三组分别腹腔注射1X10~7 PFU/100μL的oncoVV-TTL和oncoVV,100μL的PBS,共注射两次,第一次与第二次间隔15天。以oncoVV组和PBS组作为对照组通过荷瘤体积大小的测量和小动物活体成像实验来探究oncoVV-TTL对荷瘤小鼠的作用效果。结果显示oncoVV-TTL在作用小鼠荷瘤模型25天之后与oncoVV和PBS组相比对荷瘤体积的增长具有较显著的抑制作用。我们进一步通过Western blot与报告基因检测实验探究oncoVV-TTL在肝癌细胞中的作用机制。Western blot实验结果显示TTL促进ERK(Extracellular regulated protein kinases)蛋白的磷酸化,并抑制肿瘤细胞内抗病毒因子MAVS(Mitochondrial antiviral signaling protein),IFI16(Gamma interferon inducible protein 16),MDA5(Melanoma differentiation associated protein 5)的表达。报告基因检测结果显示TTL抑制干扰素IFN-β(Interferon-β)的转录活性。综上所述,我们认为TTL基因促进ERK的激活,抑制抗病毒蛋白MDA5、MAVS、IFI16、和干扰素IFN-β的表达,从而增强了病毒的复制能力,促进了oncoVV-TTL对肿瘤的抑制作用。我们进一步通过使用ERK的抑制剂U0126与病毒联合作用肝癌细胞,来检测病毒的复制是否与ERK相关。实验结果显示oncoVV不论是单独作用还是与U0126联合作用它的复制能力都没有明显变化,但oncoVV-TTL与U0126联合作用时的复制能力且显著低于oncoVV-TTL单独作用时的复制能力。这一结果证实了TTL基因促进ERK蛋白的磷酸化来增强病毒的复制。该研究为将oncoVV-TTL转化成临床的抗肝癌药物提供了研究基础。
【图文】：

PCR鉴定,包装过程,连接体,鉴定结果

VV-TTL 包装过程的鉴定结果-Flag-TTL-C1 的鉴定瑞基因有限公司合成连接在载体 pΜ pΜC57 为模板，Primer1，Primer2 切，同时对载体 pEGFP-C1 采用相同回收，按照连接体系进行连接过夜，R 鉴定，结果如图 4.1 所示：我们通基因序列。因此证明目的基因成功

序列,重组质粒,载体

模型的生长3.1.2 重组质粒 pCB-Flag-TTL 的鉴定为了获得 pCB-Flag-TTL，我们以 pEGFP-Flag-TTL-C1 载体为模板，以 Prim3，Primer4 为引物，获得目的基因 Flag-TTL，结果如下图 A 所示，Flag-TTL载体 pEGFP-Flag-TTL-C1 获得。然后使用 XbaI 和 BglII 两种限制性内切酶分对目的基因和载体 pCB 进行酶切，载体酶切结果如图 B 所示，pCB 载体被线化，其片段长度是 4800bp。分别对目的基因与载体进行割胶回收，将回收的产连接过夜，转化，挑取单克隆，摇菌后抽提质粒再次进行双酶切鉴定，鉴定结如图 C 所示，新构建的 pCB-Flag-TTL 通过双酶切可以成功的获得 500bp 的片序列，该片段大小与目的基因大小相似。为了进一步证明 Flag-TTL 序列是否功的连接在载体 pCB 上，，对载体与目的基因进行测序验证，验证结果显示没任何突变位点，可以使用构建好的 pCB-Flag-TTL 包装新型溶瘤痘苗病毒。
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7;R-332

【参考文献】