靶向SOCS3的microRNAs对HCV复制的影响及机制探讨

发布时间：2020-03-26 21:07

【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)主要通过血液途径感染肝脏,引起急性及慢性病毒性肝炎。目前全球约有1.7~2亿人感染HCV,我国健康人群HCV抗体阳性率为0.7%~3.1%。大多数HCV感染易演变为慢性感染,部分HCV慢性感染可进展为肝硬化及肝细胞癌。HCV感染已成为危害健康的严重问题。聚乙二醇α干扰素(pegylated interferon-α,PEG-IFN-α)联合利巴韦林(ribavirin,RBV)是目前抗HCV感染的经典治疗方案,但由于IFN严重的毒副作用、不同HCV基因型敏感性不同、干扰素抵抗等多种因素限制了其疗效及使用范围。近年来,随着对HCV不断深入的研究,抗HCV治疗方面取得较大成果,如抗HCV的小分子药物蛋白酶抑制剂--直接抗病毒药物(direct-acting antiviral agents,DAAs)的临床应用,相较于联合疗法持续性病毒学应答(sustained virological response,SVR)明显提高。但由于HCV基因型多、易变异且DAA治疗费用昂贵等应用受限,且近期有报道DAAs可能会增加肝细胞癌的发病率及术后复发。因此,对HCV感染相关宿主因子的探索及靶向抗HCV治疗仍是目前HCV研究的热点。HCV是单股正链RNA病毒,为黄病毒属成员,多个宿主因子被报道参与包括入侵、复制、组装和释放等在内的复制周期。microRNAs(miRNAs)是一类内源性非编码小分子RNA。大量研究表明,miRNAs可参与调控细胞分化、增殖、凋亡、代谢、细胞周期等多个环节,并与炎症性、感染性、代谢性疾病及肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关,其主要生物学功能是通过与其靶标分子的3’-UTR结合来抑制翻译或降解mRNA,进而调控基因表达。多种miRNAs已被证实在HCV诱导的肝癌(HCV-HCC)的发生发展中具有重要的作用。miRNAs在HCV的复制、诊断、治疗中同样扮演重要角色。例如,研究发现miR-122及miR-141具有促进HCV复制的作用,miR-122的小分子互补拮抗剂Miravirsen(SPC3649)目前已进入III期临床试验阶段。细胞因子信号转导抑制分子3(SOCS3)是SOCS家族的重要分子之一,大量研究表明SOCS3在多种疾病的发生发展中具有重要作用。现有研究发现SOCS3可以负性调节多种细胞因子和激素(包括IL-6、IL-10、IFN-α、LPS、瘦素、胰岛素等)产生的信号传导,从而在炎症、感染及肿瘤等多种疾病的发生发展中发挥重要作用。SOCS3在病毒感染中的作用主要与其可负性调节酪氨酸蛋白激酶/信号转导和转录激活(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)通路有关,而JAK-STATs通路是Ⅰ型和Ⅱ型IFN发挥抗病毒作用的信号通路。SOCS3的表达与HCV在细胞内的复制程度密切相关。已有研究表明,HCV患者肝样本中SOCS3蛋白表达增加,而高水平SOCS3表达与HCV患者IFN治疗抵抗相关。同时,肝细胞SOCS3水平可反应HCV感染IFN治疗的效果。SOCS3基因的多态性与宿主对抗病毒治疗的反应相关。已有报道表明SOCS3是HCV在体内复制中重要的宿主因子之一,近年来的研究表明多种miRNA可通过调节SOCS3的表达而影响多种疾病的发生发展,但鲜有靶向SOCS3的miRNAs对HCV复制及IFN抗HCV作用的影响。基于SOCS3在HCV复制中的重要作用,本课题探讨了靶向SOCS3的miRNAs对HCV复制及IFN抗HCV作用的影响。本研究中,我们首先通过SOCS3的siRNA验证了SOCS3在细胞水平对HCV复制的影响:将si-SOCS3及si-NC转染Huh7细胞,相较于si-NC,si-SOCS3除可抑制HCV在细胞内的复制,IFN-α还可进一步增强si-SOCS3对HCV复制的抑制作用。进而,以mimicNC(mNC)作为阳性对照,通过转染miRNA mimic模拟miRNA在细胞内的过表达,证实了miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p对SOCS3具有明显的抑制作用。进一步的实验中,构建含有SOCS3 3’-UTR(WT)及miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p与SOCS3 3’-UTR结合位点突变的质粒,利用双荧光素酶报告基因验证了SOCS3是miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p的靶标分子。在此基础上,通过利用HCVcc感染,在细胞模型上证实了miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p在抑制HCV复制的同时也抑制了SOCS3的表达。而在用IFN-α处理后,miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p对HCV复制的抑制作用进一步加强。以往的研究已证实SOCS3是JAK-STATs通路重要的负性调节因子之一,而IFN-α抗HCV的作用正是通过作用于JAK-STATs通路,IFN-α上调该通路下游p-STAT1的表达发挥其抗HCV的作用。因此,我们分别转染si-SOCS3、miR-185-5p mimic、miR-19b-3p mimic、miR-30c-5p mimic及对照,结果发现,相较于对照,si-SOCS3、miR-185-5p mimic、miR-19b-3p mimic及miR-30c-5p mimic均可明显上调p-STAT1的表达,从而进一步证实了IFN-α增强靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p抑制HCV复制的作用是通过共同加强JAK-STATs通路作用而实现的。基于上述发现,靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p可在细胞模型中抑制HCV复制,其作用是通过互补结合SOCS3 mRNA的3’-UTR抑制了SOCS3蛋白的表达。这一抑制作用解除或削弱了SOCS3对JAK-STAT通路的负性调节作用,明显上调了p-STAT1的表达,而p-STAT1是IFN-α发挥抗HCV效应的中介因子之一。因此,靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p表现出抑制HCV复制及协同IFN-α抗HCV的作用。该研究有助于将SOCS3作为对IFN治疗反应的标志物提供更多的证据,同时为研发基于SOCS3的潜在疗法奠定基础,为拓宽IFN治疗HCV感染提供更多依据。
【图文】：

si-SOCS3对Huh7细胞中SOCS3表达的影响

图 2. si-SOCS3 对 HCV mRNA 和蛋白表达的影响Figure 2. Effects of si-SOCS3 on HCV mRNA and protein exCS3 mRNA expression is downregulated by si-SOCS3 detec.01). B. HCV mRNA expression is downregulated by si-SO
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373.21

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本文编号：2601964