沙眼衣原体GlgA蛋白分泌机制初探及相互作用蛋白的筛选

发布时间：2020-03-27 05:06

【摘要】：[目的]:寻找调控沙眼衣原体GlgA蛋白表达和分泌的分子机制的同时,利用酵母双杂交系统从人宫颈癌上皮细胞cDNA文库筛选出与GlgA相互作用的分子,为进一步研究GlgA的分子功能提供理论基础,也对阐明沙眼衣原体的致病机制提供实验依据和新思路。[方法]:(1)分析Ct D型标准株ORFs,给衣原体编码基因设计特异性扩增引物。利用PCR扩增技术以获得目的基因,将构建好的PGEX-6P-1/GlgA原核表达重组质粒转入大肠杆菌BL-21,以0.4mM IPTG的浓度条件诱导表达重组GlgA蛋白。(2)采用SignalP-4.1软件对GlgA蛋白N端进行信号肽预测分析,并用细菌分泌蛋白特异性阻断剂C16和C1化合物分别或同时处理Ct感染的HeLa细胞,观察阻断Ⅱ型、Ⅲ型分泌途径对GlgA蛋白分泌的影响;经新生霉素处理、噬斑筛选及穿梭质粒转染技术,构建Ct质粒缺失株和缺失互补株,并鉴定质粒编码基因在两种菌株的缺失及表达情况;间接免疫荧光法观察质粒缺失对GlgA表达和分泌的影响。(3)应用酵母双杂交技术筛选出GlgA的互作蛋白:将GlgA基因cDNA克隆构建到酵母双杂交的诱饵载体上,并对载体进行PCR扩增、Sfi I酶切,将得到的克隆片段与酶切后的p GBKT7诱饵载体质粒连接,利用PCR法扩增质粒引物,对重组的诱饵质粒pGBKT7-GlgA进行酶切与测序鉴定。将诱饵质粒pGBKT7-GlgA和pGBKT7空载转化AH109酵母感受态细胞,进行诱饵质粒pGBKT7-GlgA的毒性检测和自激活检测。同时筛选人宫颈癌上皮细胞cDNA文库,并纯化足够的质粒以转化酵母细胞,把含有诱饵质粒pGBKT7-GlgA的酵母菌与人宫颈癌上皮细胞c DNA文库融合后,将杂交产物分别铺板于SD/-Trp、SD/-leu、SD/-His、SD/-Ade固体培养平板上,筛选阳性克隆。提取pGBKT7-GlgA质粒,对阳性克隆进行测序及比对分析。[结果]:(1)双酶切及测序的结果表明GlgA的基因序列正确。纯化的GlgA蛋白经12%SDS-PAGE电泳和WB分析,可以发现在相应的位置有明显的蛋白条带,其蛋白分子量与预期结果相符。(2)GlgA蛋白N端无信号肽序列,细菌Ⅱ型、Ⅲ型分泌途径特异性阻断剂C16和C1化合物不能阻断GlgA的胞浆分泌;Ct质粒缺失株CTD1的质粒编码基因pgp7丢失,且质粒编码蛋白Pgp3及基因组编码蛋白GlgA的表达和分泌现象均消失;Ct缺失互补株CTD1-pGFP::SW2重新获得pgp7基因,并恢复Pgp3蛋白和GlgA的表达和分泌。(3)成功构建p GBKT7-Glg A诱饵质粒,通过检测后证明其自身无毒性、自激活能力,并且可以在酵母菌中表达。诱饵质粒转入文库后经过两轮筛选,共得到11个阳性克隆。[结论]:本实验初步证实Ct糖原合酶GlgA蛋白的表达和分泌不依赖细菌Ⅱ型和Ⅲ型分泌途径,而与衣原体质粒密切相关。同时,以GlgA基因cDNA克隆为诱饵,筛选人类酵母双杂交文库,经过两轮文库筛选后一共筛选到11个初始阳性,对DNA测序结果进行BLAST比对分析,表明这11个阳性克隆分别编码4种蛋白,大致分为以下几类:(1)结合蛋白类(如CAPG);(2)转录因子类(如CXXC1);(3)凋亡相关蛋白类(如肿瘤抑制因子PHB);(4)脂蛋白类(如APOA1BP),它们均有重要的生物学功能。
【图文】：

图 1A SDS—PAGE 分析 GlgA 蛋白表达的结果Fig.1ASDS-PAGE analysis of GlgA protein expression1 strain without IPTG at 37℃and 220rpm conditions induced for 6h; 2:BLded with 0.2mM IPTG at 37℃and 220rpm conditions induced for 6h; 3:BL21 swith 0.4mM IPTG at 37℃and 220rpm conditions induced for 6h; 4:BL21 s

BSDS-PAGE分析GlgA蛋白的纯化
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R374

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本文编号：2602507