MiR-101a表观调控Cox-2基因表达及软骨发育的相关性研究

发布时间：2020-03-28 04:41

【摘要】：MicroRNAs是内源性的干扰体内蛋白生成的非编码RNAs,可抑制m RNA翻译为蛋白质的过程同时也可以调节m RNA的稳定性,从而成为了调控基因表达的关键因素。近年来的研究发现,micro RNAs中的一个关键的成员mi R-101在哺乳动物体内的正常生理(如血管的生成,受精卵的着床)以及病理状态下(如实体瘤的发生发展和关节炎的进程中)均起到非常关键的作用。本综述将着重讨论micro RNA如何通过调控转录因子,信号通路蛋白,表观遗传调控过程的关键蛋白因子以及体内的一些关键酶类来发挥其生物学效应。通过以上的综述将帮助我们系统地了解mi R-101在体内生理病理状态下发挥作用的方式,从而为今后mi R-101可能的临床应用提供科学依据。研究背景:软骨内骨形成被认为是人体内长骨或四肢骨发生的重要形式,在这一过程中静息的软骨细胞不断增殖,同时伴随着II型胶原和蛋白聚糖的积累,最后软骨细胞在相关转录因子的调控下转变为肥大软骨细胞并同时积累X型胶原蛋白。软骨细胞的肥大伴随而来的是肥大时期相关的基因如Col10a1、Cox-2和Mmp-13等表达量增高。环氧化酶2(Cox-2)是已知的机体受到相应刺激后快速产生的一种诱导酶,具有广泛生理作用。本实验室此前的研究表明,Cox-2表达增高促进软骨细胞向肥大方向分化,这主要是通过调控肥大软骨的相关标记基因如Col10a1实现的。研究目的:(1)探究mi R-101a mimic和inhibitor干预后对肥大期MCT和ATDC5软骨细胞肥大相关基因Col10a1、Cox-2以及Mmp-13的作用,同时探索mi R-101a mimic和inhibitor干预后对于软骨细胞肥大化进程的影响。(2)探索mi R-101a mimic和inhibitor干预后在增殖期MCT和ATDC5中对软骨细胞增殖情况的影响。(3)探究mi R-101a调控软骨细胞发育过程的潜在机制。研究方法:(1)运用Targetscan,Mi Randa网站在线预测Cox-2和Col10a1的3’UTR区域是否存在mi R-101a的结合位点。通过荧光素酶报告基因实验分析,确认mi R-101a与Col10a1、Cox-2的3’UTR区域的结合位点。(2)随着培养条件的改变,两株软骨细胞模型由增殖期向肥大期的转化。应用荧光定量PCR技术,在小鼠MCT和ATDC5两株细胞系检测两个时期Col10a1、Cox-2和mi R-101a的表达情况。(3)通过瞬时转染MCT细胞和慢病毒稳定转染ATDC5细胞得到mi R-101a mimic和inhibitor干预细胞模型;并应用荧光定量PCR技术、免疫印迹技术(WB)、Ed U细胞增殖成像技术和细胞染色技术来探讨mi R-101a mimic和inhibitor干预后对软骨细胞增殖和肥大化进程的影响。(4)应用Pathway Builder Tool2.0(www.proteinlounge.com)软件绘制简单的基因相互作用结构图谱来阐释mi R-101a与一些肥大软骨时期相关基因的关系网络图。研究结果:(1)生物信息学网站预测结果显示mi R-101a与Cox-2、Col10a1的3’UTR区域存在结合位点。进一步地,相应报告基因的分析结果显示mi R-101a与Cox-2的3’UTR区域存在结合,然而与Col10a1的3’UTR区域不存在明显结合。(2)荧光定量PCR的结果显示:与增殖期的MCT和ATDC5细胞相比,软骨细胞肥大时期相关基因Col10a1、Cox-2呈现高表达状态,而mi R-101a基因表达降低。(3)在MCT和ATDC5细胞中mi R-101a mimic干预后,结果显示mi R-101a抑制软骨肥大相关基因的表达;在MCT和ATDC5细胞中mi R-101a inhibitor干预后,结果显示软骨肥大相关基因表达增高。在两株软骨细胞中mi R-101a mimic和inhibitor干预后对Sox9和Runx2基因表达没有产生明显影响。(4)Ed U细胞增殖成像和阿尔新蓝染色结果显示mi R-101a mimic干预后可抑制软骨细胞的增殖,mi R-101a inhibitor干预后可促进软骨细胞增殖。研究结论:生物信息学预测Cox-2与Col10a1基因3’UTR存在mi R-101结合位点,进一步地荧光素酶报告基因实验表明mi R-101a只与Cox-2的3’UTR区域存在结合作用。Mi R-101a可能通过调节靶基因Cox-2,调控基因表达并在软骨发育时期发挥了重要作用。
【图文】：

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生物信息学网站关于microRNAs与靶基因的相互作用位点分析
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R394

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本文编号：2603940