莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT57的多克隆抗体制备

发布时间：2020-03-28 06:29

【摘要】：莱茵衣藻是一种具有两条等长纤毛的单细胞真核藻类,具有细胞周期短、实验操作简单等优点,是一种比较典型的模式生物。纤毛是由细胞微管构成的,处于细胞表面的保守器官。纤毛内蛋白的组装、维持和解聚主要依赖于“鞭毛内运输”(intraflagellar transport,简称IFT)机制,将蛋白复合体从纤毛基部到顶端的一种双向运输过程。纤毛内结构或功能发生异常,会引起肥胖、糖尿病、内脏转移、多囊肾病、色素性视网膜炎、复性呼吸道感染、不育症、智力迟钝、多趾等症状。因此,研究IFT机制中蛋白颗粒复合物的相关作用,对纤毛病的发病机理和预防显得尤为重要。IFT57位于IFT-B1和IFT-B2之间,参与纤毛内的正向运输,其对纤毛的组装和维持是必须的。IFT57是与运动有关的蛋白,它的缺失导致纤毛轴丝蛋白的损伤,会影响信号传导,导致细胞运动能力丧失。但是人们对于其具体调节机制及其他功能还有待了解。因此,制备莱茵衣藻IFT57抗体,为进一步研究其维持纤毛长度和功能提供了前提。本研究通过对ift57基因的CDS序列进行生物信息学分析,选取其N端319～469 aa亲水性序列,经过PCR体外扩增获取目的片段。分别构建了带有6×His和MBP标签的原核表达载体pET-28a(+)-ift57和pMAL-c2X-ift57,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经0.2mMIPTG诱导表达蛋白,以12%SDS-PAGE鉴定,分别获得分子量大小为18 KDa和57.2 KDa的重组蛋白片段。对两种融合蛋白进行亲和层析纯化,将6×His-IFT57目的蛋白作为抗原,用其免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血液并分离血清。用MBP-IFT57目的蛋白作为固相结合物,利用间接ELISA法测定抗血清的效价,结果显示大于256000。将抗血清经Protein A纯化后,Westem blotting检测显示所制备的IFT57多克隆抗体,能够特异性识别衣藻中的IFT57蛋白。这一结果为表达纯化溶解性较差的蛋白,及其抗体制备提供了借鉴意义。同时,所获抗体为深入研究IFT57在鞭毛组装中的作用机理奠定了坚实基础。
【图文】：

纤毛,帽子,基体,顶端

连接桥相连。这些与运动相关的蛋白结构用于调控纤毛的运动。相反，不动纤毛缺逡逑少两个中央微管，（“９＋０”型），，不包含与运动相关的蛋白，不能运动【２？６］。此外，逡逑埋藏在细胞内的纤毛基体没有中央微管，仅由９个三联体的细胞微管构成（图１－１）。逡逑研究发现在纤毛的顶端还有一个类似帽子的结构，通过丝状结构与顶端的纤毛逡逑膜和底部的中央微管相连，我们称之为“鞭毛帽子复合体”邋［２＇目前对该结构的认逡逑识还不清楚。此外，在纤毛的基体上面存在调控蛋白进出纤毛的结构－过渡纤维逡逑（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｆｉｂｅｒ）。从基体顶端到中央微管的区域，区域的中央有１个桶状和一个管逡逑状结构上下排列，即上文所述的过渡区［２８】。逡逑２逡逑

鞭毛,纤毛

驱动蛋白－２邋（ｋｉｎｅｓｉｎ－２）提供动力，由纤毛基部到顶端发生运动［４２］；逆［＾输是依逡逑靠亚蛋白复合物ＩＦＴ－Ａ，利用细胞质动力蛋白（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ邋ｄｙｎｅｉｎＤｈｃｌｂ）提供动力，逡逑由纤毛顶端到基部的运动［５３，５４】（图１－３）。其中，纤毛亚基蛋白ＥＦＴ复合体Ａ和复合逡逑体Ｂ的突变，会引起纤毛运动性的丧失或纤毛的缺陷，从而导致人类出现肥胖、糖逡逑尿病、内脏转移、多囊肾病、色素性视网膜炎、复性呼吸道感染、不育症、智力迟逡逑钝、多趾等症状［５５】。马达蛋白的缺陷，会导致新的纤毛无法生成或者己经ｋ成的纤逡逑毛发生缩短解聚。另外，ＩＦＴ转运蛋白也参与了纤毛信号传导过程，许多＃号传递逡逑通路（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｗｎｔ，邋ＰＤＧＦＲａａ）是转运蛋白进出纤毛所必须的［２９】。因！ｌｉｔ，研究逡逑ＩＦＴ机制中两种马达蛋白的转换、ＩＦＴ蛋白颗粒复合物的进出机制等相关作用，对纤逡逑毛病的发病机理和预防显得尤为重要。逡逑５逡逑
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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