伤寒沙门菌小RNA SbfR相关功能研究

发布时间：2020-03-28 10:25

【摘要】：目的:小RNA SbfR是本课题组通过Solexa高通量测序技术首次在伤寒沙门菌中发现的一个非编码RNA,相关分子特性分析结果显示,SbfR可能是一反式编码RNA。本论文旨在初步探索SbfR在伤寒沙门菌中发挥的调节作用和机制,为后续研究SbfR靶基因及作用机制奠定基础。方法:1.伤寒沙门菌转录组分析:将SbfR缺陷株(ΔSbfR+p BAD)和SbfR回补株(ΔSbfR+p BAD-SbfR)培养至对数期(OD600≈0.4),加入L-阿拉伯糖诱导后提取细菌总RNA,加入荧光素进行逆转录,标记后的c DNA与全基因组芯片杂交,扫描并进行数据分析,比较SbfR缺陷株和回补株基因表达谱差异。选择部分差异表达基因进行q RT-PCR,验证基因芯片结果。2.q RT-PCR分析基因表达:分别提取各菌株总RNA并逆转录为c DNA,进行q RT-PCR实验,检测基因的m RNA水平。3.细菌在不同温度下的生长曲线测定:分别在37°C和42°C培养SbfR缺陷株和回补株,每隔1h检测OD600值,以OD600数值作纵坐标,以时间作横坐标,绘制SbfR缺陷株和回补株的生长曲线,比较SbfR对细菌在两种温度下生长情况的影响。4.SbfR片段分部回补株构建:分别构建连有SbfR前69nt和后69nt片段的重组载体,所用质粒为p BAD/Myc-His A,并将重组载体电转入ΔSbfR,制备前69nt和后69nt SbfR片段回补株。5.细菌动力实验:将空载体株(WT+p BAD)、SbfR缺陷株、SbfR回补株及SbfR片段分部回补株分别培养至对数期,用接种针蘸取菌液点种于LB半固体动力板,置于37°C孵箱过夜,测量细菌圈直径,分析SbfR对细菌动力的影响。6.Western-blot检测Flj B表达水平:将空载体株、SbfR缺陷株和SbfR回补株培养至对数期,收集全菌蛋白,用兔抗Flj B抗血清进行Western-blot实验,检测各菌株Flj B表达水平。7.He La细胞侵袭实验:将空载体株、SbfR缺陷株和SbfR回补株培养至对数期,与He La细胞共孵育90min,弃去培养液。一半细胞孔中加入Triton裂解细胞,涂板培养,计数菌落数为粘附水平;一半细胞孔中加入庆大霉素培养90min后,加入Triton裂解细胞,涂板培养,计数菌落数为侵袭水平。8.生物膜形成实验:在TSB培养基中分别培养空载体株、SbfR缺陷株、SbfR回补株及SbfR片段分部回补株至对数期,转种至96孔板,30°C静置4天,洗去浮游细菌并用结晶紫对生物膜染色,30%冰醋酸洗脱后595nm比色测定。结果:1.基因芯片分析结果显示,SbfR缺陷株与回补株之间共99个基因表达水平存在差异;q RT-PCR结果与基因芯片分析数据相比,基因变化趋势一致。2.生长曲线测定结果表明,在37°C条件下SbfR缺陷株与回补株的生长情况一致,而在42°C条件下回补株的生长明显慢于缺陷株。3.成功构建SbfR前69nt片段和后69nt片段的回补株(ΔSbfR+p BAD-F69,ΔSbfR+p BAD-L69)。4.动力实验结果表明,与空载体株相比,SbfR缺陷株动力下降,回补株动力恢复;两部分SbfR片段回补株动力均恢复到空载体株水平,且与SbfR全长回补株动力水平一致。5.与空载体株相比,SbfR缺陷株Flj B表达水平下降,回补株Flj B表达水平恢复。6.与空载体株相比,SbfR缺陷株对He La细胞的侵袭能力下降,回补株的侵袭能力恢复。7.与空载体株相比,SbfR缺陷株的生物膜形成能力下降,回补株的形成能力恢复。两部分SbfR片段回补株生物膜形成能力均部分恢复,与空载体株水平一致,但比SbfR全长回补株弱。8.SbfR缺陷株hsl S、hsl T、htp G、fli A、flj B、sop E等基因的转录水平低于SbfR回补株;flh D的转录水平高于SbfR回补株;prg J、fim A、csg A、yih P、rfa D、bcs A、wca A、bap A等基因的转录水平与SbfR回补株的差异无统计学意义。结论:sRNA SbfR参与伤寒沙门菌热应激条件下生长、动力、侵袭、生物膜形成等方面的调节,抑制热应激条件下细菌生长,促进细菌动力、侵袭和生物膜形成能力。SbfR前69nt和后69nt回补株均可独立完成全长SbfR对细菌动力的促进作用,但在形成生物膜能力方面两种部分回补株分别发挥全长SbfR的部分调控作用。
【图文】：

伤寒沙门菌小 RNA SbfR 相关功能研究稳态期表达量较高；酸应激条件下，SbfR 表达上调，氧应激条件下，，表达量下调[54,55]。但是 SbfR 在 S. Typhi 中发挥的作用有待进行深入研究。

伤寒沙门菌小 RNA SbfR 相关功能研究3 实验结果3.1 基因芯片3.1.1 SbfR 缺陷株与 SbfR 回补株双色荧光叠加图将两张基因芯片的扫描结果经计算机处理，数据叠加后产生图像，如图3.1。在A 图中，绿色表示该基因在缺陷株中转录水平比回补株低，红色表示该基因在缺陷株中转录水平比回补株高。B 图与 A 图相反，绿色表示该基因在缺陷株中转录水平比回补株高，红色表示该基因在缺陷株中转录水平比回补株低。黄色点为绿色荧光和红色荧光的中和效果，表明该基因在SbfR 缺陷株和回补株中的表达丰度相似。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378.22

【参考文献】

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1 王哲鑫;吉滢;赵昕;徐顺高;黄新祥;;非编码小RNA T64对伤寒沙门菌基因表达的影响[J];江苏大学学报(医学版);2014年04期

2 郭志燕;周明旭;段强德;朱国强;;细菌鞭毛的致病性及其免疫学应用的研究进展[J];微生物学报;2014年03期

本文编号：2604322