骨髓间充质干细胞来源的外泌体促进骨再生的效果与机制研究

发布时间：2020-03-28 11:12

【摘要】：背景:骨再生一直是骨科领域研究的热点问题,有效的骨再生治疗依然存在巨大临床需求。随着组织工程研究的逐渐深入,间充质干细胞在组织再生中的重要性得到了越来越多的关注。骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因其获取方法方便而较为常用,有研究指出,MSCs的上清液同样有修复受损组织的功能,其作用可能与干细胞通过旁分泌囊泡调节靶细胞功能有关。外泌体(Exosome)作为干细胞旁分泌成分之一,在干细胞调节靶细胞功能中起到了十分重要的作用。外泌体一般直径为40-160 nm,其内包含源细胞内合成的mRNA、miRNA、酶等成分,通过出芽的方式进入细胞外基质,被靶细胞内吞后释放内部成分,完成细胞间的通讯和信息交流。外泌体可以有效修复受损的组织、器官如心、肺、肾、脑等,说明移植外泌体可以发挥移植干细胞类似的作用。因此我们推测骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BMSC-Exos)能表现出与BMSC相似的生物学功能,即促进骨再生。本课题将研究BMSC-Exos对骨再生的促进作用,并初步探索骨再生的机制,希望能为将来外泌体治疗骨再生提供理论依据,也为临床解决骨再生的提供新的线索和思路。目的:本研究旨在检测骨髓间充干细胞外泌体(BMSC-Exos)的特征,并通过体内体外实验验证其促进成骨分化的能力,同时探讨其促进骨再生的机制。方法:(1)原代培养人骨髓间充质干细胞(BMSCs),并对其表面抗原和多系分化潜能进行鉴定;(2)收集BMSC的P4-P6代细胞培养的培养上清液,通过试剂盒法提取BMSC-Exos;(3)透射电镜观察BMSC-Exos的形态结构,免疫电泳检测BMSC-Exos的表面抗原;(4)茜素红、ALP染色验证BMSC-Exos在体外促进成骨分化能力;(5)通过大鼠颅骨缺损动物模型验证BMSC-Exos在体内促进骨再生的能力;(6)通过免疫电泳和qRT-PCR检测加入BMSC-Exos后的成骨细胞中相关蛋白和基因的表达情况。结果:(1)分离培养的BMSCs形态呈多角形或长梭形,表面抗原CD90、CD29、CD44为阳性,符合间充质干细胞的特征。(2)BMSC-Exos呈双面凹的圆形或椭圆形,直径约40~120nm(81.7±19.9),表面抗原与BMSC一致。(3)经茜素红染色和ALP染色后,Exo组染色强度明显高于对照组,且染色强度与Exo浓度呈正相关。(4)通过对大鼠颅骨缺损模型拍摄X片、组织学分析,外泌体组的骨缺损修复情况优于对照组,且有更多新生骨的形成。(5)免疫电泳显示经外泌体处理后,MSC细胞中的OCN、Runx2、β-catenin蛋白含量增加,qRT-PCR结果显示Runx2、β-catenin的基因表达上调。结论:BMSC-Exos有促进骨再生的能力,并与上调Wnt/β-catenin通路有关。
【图文】：

形态图,形态,多角形,细胞核

BMSC 传代细胞形态：呈多角形或长梭形，细胞核大，形态均MSC 表面抗原表达情况：选择 P4 代 BMSC 细胞进行表析 BMSC 细胞表面抗原标志物。结果显示，高表达 CDMSC 标志物，低表达 CD34、CD45 等标志物（表 1）。MSC 符合间充质干细胞特征。表 1：BMSC 细胞表面标志物表面抗原 BMSC 百分比（%CD29 97±0.43CD44 98±0.22CD90 98±0.78CD34 -CD45 -SC 多系分化潜能鉴定：成骨诱导培养 3w 后进行茜素红

诱导培养,磷脂双分子层,油红,骨髓间充质干细胞

图 2：BMSC 分别经成骨诱导培养和成脂诱导培养后，，茜素红染色（左）和油红 O 染色（右均呈阳性。2.2.2骨髓间充质干细胞外泌体（BMSC-Exos）的特征（1）BMSC-Exos 形态学特征：TEM 下观察外泌体呈两面凹的椭圆形或形，直径 40~120nm（81.7±19.9），有完整的磷脂双分子层膜结构。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

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