血清miR-146b在脓毒症相关AKI小鼠模型中的作用及其在AKI临床早期诊断中的应用评估

发布时间：2020-03-28 18:36

【摘要】：目的前期研究结果显示顺铂诱导的肾损伤大鼠模型中miR-146b表达上调,而间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)移植后下调,提示MSC能降低miR-146b表达而对顺铂诱导的急性肾损伤起保护、修复作用。结合临床肾病患者血清miR-146b较健康人表达明显上升,预测miR-146b可能成为肾损伤的早期分子标志物之一。在此基础上,本课题构建了人脐带间充质干细胞来源的外泌体(exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cell,hucMSC-exosomes)介导的小鼠脓毒症相关急性肾损伤修复模型,揭示miR-146b在脓毒症相关急性肾损伤中的作用及机制,并检测临床不同病因导致的急性肾损伤患者AKI早期血清miR-146b水平,以评估其作为AKI早期诊断标志物的应用价值。方法盲肠结扎穿刺术法构建小鼠脓毒症相关急性肾损伤模型(CLP模型),以假手术组(Sham组)为对照组,修复组(hucMSC-exosomes组)术后腹腔注射hucMSC-exosomes,损伤组(CLP组)术后腹腔注射等量PBS。收集术后Oh、24h各组小鼠的血清标本及24h各组小鼠的肾脏标本,结合小鼠症状表现及肾功能(血清肌酐、尿素氮)变化、组织病理学结果验证造模成功。PCNA免疫组织化学染色检测各组肾组织细胞增殖能力,Western Blot分析增殖凋亡相关蛋白Caspase 3的表达,综合判断hucMSC-exosomes对脓毒症相关急性肾损伤的损伤肾组织的保护及修复作用。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测各组肾组织中miR-146b的表达水平,探讨脓毒症相关急性肾损伤中miR-146b的反应性。结合大量文献资料,预测miR-146b在hucMSC-exosomes介导的小鼠脓毒症相关急性肾损伤修复中作用的靶基因IRAK1和TRAF6,qRT-PCR检测模型中各组肾组织中IRAK1和TRAF6及下游NF-κB通路相关蛋白的表达水平,初步揭示miR-146b在hucMSC-exosomes介导的小鼠脓毒症相关急性肾损伤修复中的作用机制。针对不同临床病因导致的急性肾损伤患者的血清标本进行分类预收集,Taq-man qRT-PCR检测确诊AKI患者明确诊断前至少3天的血清中miR-146b及血清肌酐、尿素氮的表达水平,评估miR-146b在临床早期诊断AKI中的应用价值。结果模型中各组的血清肌酐和尿素氮水平及肾组织切片HE染色结果表明,利用CLP法可成功构建小鼠脓毒症相关急性肾损伤模型,PCNA免疫组织化学染色及Western Blot结果显示hucMSC-exosomes能刺激损伤的肾组织细胞增殖再生,并减弱受损肾组织细胞的凋亡。此外,miR-146b在脓毒症相关的急性肾损伤的损伤肾组织较正常组织中的表达无明显变化,而在经hucMSC-exosomes修复后的肾组织中表达明显上调(P0.001)。qRT-PCR结果显示IRAK1基因和TRAF6基因的相对含量损伤时明显升高,而hucMSC-exosomes修复后又显著下降,与miR-146b的变化反向一致。Western blot显示了与qRT-PCR同样的结果。免疫组化染色结果显示损伤组NF-κB抑制蛋白αIKBα(IKBα)、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(pIKBα)、NF-κB蛋白p65和p-p65(磷酸化NF-κB蛋白p65)一致表达升高,修复时IKBcα表达进一步升高而pIKBα、p65和p-p65表达有所回降。qRT-PCR结果表明TNF-α和IL-1p的mRNA表达水平在损伤组表达显著升高而在修复组有所下降但仍高于假手术组(PO.OOl)。收集的53例不同病因的确诊AKI患者血清标本,67.9%(36例)的血清标本检测到hs-miR-146b-5p有2倍到50倍以上不同程度的表达升高,其中肾前性AKI患者5例,肾性AKI患者30例,脓毒症相关AKI患者1例。且血清中hs-miR-146b-5p的变化较血清肌酐和尿素氮提前了至少24h。结论CLP模型中,hucMSC-exosomes表现出同其他类型急性肾损伤模型中相似的修复作用,但其miR-146b的表达与其他类型急性肾损伤模型不一致,提示其可能在脓毒症相关急性肾损伤中有不同于其他类型急性肾损伤的调节作用。miR-146b通过抑制IRAK1基因和TRAF6基因抑制NF-κB的活化进而抑制炎性损伤而在hucMSC-exosomes介导的脓毒症相关急性肾损伤修复中发挥作用。miR-146b在不同病因导致的急性肾损伤中有不同程度的表达升高,该变化比血清肌酐和尿素氮升高提前了至少24h,提示miR-146b可作为不受病因干扰的普遍敏感的急性肾损伤早期诊断标志物应用于临床。
【图文】：

图 1. 1 m iR - 1 46 b 调 控的 主 要 信号 通 路及 作 用机 制 F ig u r e 1. 1 Ma i n s ig n a l pa t h w ay s an d m ec ha n i s m s o f m iR - 14 6b r eg u l a t i on 1 .2 急 性肾 损 伤 1. 2. 1 急性 肾 损 伤诊 断 标准 、 病 因及 治 疗 20 0 5 年急 性肾 损 伤网 络（A K IN ）制定 的 新急 性 肾损 伤 共识 将 急性 肾 损伤 （ ac u t e k id n e y in j u r y ，A K I ）定 义 为 ：3 个 月以 内 出 现 的血 、 尿 、 组 织检 测 或影 像学 等 方面 的 肾脏 功 能 或 结构 异 常。 20 1 2 年 K DI G O 指 南确 立 了最 新的 AK I 诊 断标 准 ：4 8 小时 内血 清 肌酐 水 平 升 高 ≥0 .3 m g / d l （≥ 26 . 5 μm o l/ L ）或 超 过基 础 值的 1 .5 倍 及以 上 ，且 明 确 或经 推 断上 述 情况 发 生在 7 天之 内 ； 或持 续 6 小时 尿 量＜ 0 . 5m l / （k g ·h ）[4 7 ] 。依 据 引 起急 性 肾损 伤 的 原因 可 分 为肾 前性 AK I （ 手术 、烧 伤 等致 血容 量 急剧 减少 ） 、肾 性 AK I（ 肾 毒性 药 物如 呋塞 米 、甘 露醇 、氨 基 糖苷 类 ， 最 常 见， 占 4 0% ） 和 肾 后 性 AK I （各 种 原 因 引起 的 急性 尿 路梗 阻 ，

患 者 的 mi R - 14 6b 表 达 水 平[6 5 ] ，， 发 现 临 床 肾水 平显 著 性 高于 健 康人 ， 且 血清 mi R - 14 6 b 较肌 实 验和 体 外实 验 两方 面 证 实 了 mi R - 1 46 b 作为 A性 。 对转 染了 mi R - 14 6b 抑 制剂 的 N RK - 5 2E 细 胞进 l o t 检测 证 明了 er b B 4 是 mi R - 14 6 b 的直 接 靶基 因 在 mi R - 14 6b 敲 减细 胞 中 显著 高 表达 ； 随 后又 构 建We s t e r n Bl o t 结果 显示 er b B 4 下游 相 关蛋 白 st a t 5 [6 5 ] 。因 而 推 测出 mi R - 14 6b 在 顺铂 诱 导 的急 性 肾 本 课题 将 在 前期 研 究基 础 上探 讨 mi R N A1 46 b 在 关急 性 肾 损 伤体 外 模 型 中的 作 用 及 机制 并 评 估 其
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7;R-332

【参考文献】

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本文编号：2604757