雌性小鼠高龄生育对子代学习记忆及海马HSC70表达的影响

发布时间：2020-03-29 05:38

【摘要】：高龄生育逐年增加已经成为一个全球性的趋势,而我国在2016年1月1日全面二胎政策的实施致使国内高龄母亲生育的问题尤为突出。母亲高龄生育带来的负面效应有很多,比如子代的唐氏综合症、精神障碍等患病率比适龄生育更高,并且大样本量的流行病学研究表明母亲高龄生育对于子代的智力发育有负面影响。本实验室已经通过Morris水迷宫实验在SD大鼠证明母亲高龄生育引起子代学习记忆能力降低,但是在目前在小鼠模型上尚无相关数据。智力的发育与位于大脑丘脑与内侧颞叶之间的海马体相关,而海马体中主要由神经元细胞和神经胶质细胞发挥其学习记忆功能。神经元通过接受、整合、传到和输出信息实现信息的交换,可通过微管关联蛋白2(microtubule-associated proteins 2,MAP2)标记;而作为神经胶质细胞主要组成部分的星形胶质细胞对于维持神经元的生长、发育和生存发挥着至关重要的作用,可通过胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)标记。因此,海马的发育或功能异常将引起学习记忆功能改变。热休克蛋白(heat shock proteins,Hsps)是一组高度保守的蛋白质,对于新生多肽的正确折叠以及蛋白质复合物的形成和稳定具有重要作用。热激同源蛋白70(heat shock cognate protein 70,HSC70)是Hsps家族的一个主要的结构性活性成员,不同于热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)在细胞处于应激环境时高表达以发挥应激保护作用,HSC70在正常细胞中呈基础性表达,从而维持细胞的基本形态和功能。HSC70在神经系统中大量表达,其表达随着神经系统发育出现时间和空间改变,提示其参与神经发育。本文研究C57BL/6雌鼠高龄生育对于子代学习记忆的影响,检测神经发育过程中高龄生育子代海马HSC70的表达特征,为高龄生育相关的医学研究和生育指导提供新的思路。方法1.实验动物和分组:选用清洁级C57BL/6小鼠。分别取高龄雌鼠(11月龄)和青年雌鼠(3月龄)与随机选择的3月龄雄鼠单独合笼。待雌鼠怀孕后,将雄鼠与雌鼠分笼。雌鼠分娩后,将高龄雌鼠所生育仔鼠标记为高龄组,青年雌鼠所生的仔鼠标记为青年组。对待检测小鼠称重。2.Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力:小鼠出生后28天(postnatal 28,P28)为脑发育成熟期,出生后60天(postnatal 60,P60)为成年期。将仔鼠分为两组,第一组饲养至P28进行水迷宫检测,第二组饲养至P60进行水迷宫检测,分别记录其实验前体重及定位航行实验与空间探索实验中的相关指标。3.免疫组织化学荧光染色检测海马中HSC70蛋白表达:对P28青年组与高龄组处死后取全脑组织进行免疫组织化学染色,检测HSC70、MAP2、GFAP在海马区表达,在共聚焦显微镜下观察并用Image-Pro Plus软件测定荧光强度值。4.Western blot检测发育过程中海马Hsc70蛋白表达:青年组、高龄组出生后1、3、7、14、21、28、60天处死后取海马组织,进行Western blot对小鼠在生长过程中海马中Hsc70蛋白表达情况进行动态的检测。5.Western blot检测水迷宫训练前后海马HSC70和HSP70蛋白表达:对P28青年组的小鼠水迷宫前后海马中HSC70与HSP70的蛋白表达变化进行检测。6.统计学分析:本文中所涉及的数据统计由SPSS17.0软件分析。水迷宫实验的定位航行实验采用重复测量数据的多因素方差分析。当两组样本进行比较时,如果成正态分布且方差齐则运用两独立样本t检验;成正态分布但方差不齐时运用校正t检验;不满足正态分布时运用秩和检验。检验水准为α=0.05。结果1.小鼠体重:P28青年组与高龄组小鼠体重均值分别为16.98±1.11 g和16.05±1.15 g;P60青年组与高龄组小鼠体重均值为27.21±1.64 g和26.37±1.74 g,均无统计学差异(P0.05)。2.Morris水迷宫结果:定位航行实验中随着第1天到第6天训练时间延长,高龄组和青年组(P28和P60)到达平台的潜伏期均显著降低(P0.05)。在训练第6天,高龄组潜伏期在P28明显比青年组长(P0.05),而在P60与青年组则无显著差异(P0.05);高龄组的游泳路程在P28和P60与青年组相比均无显著差异(P0.05)。第七天空间探索实验时,高龄组的目标象限时间百分比在P28和P60均显著低于青年组(P0.05);且高龄组穿越平台次数在P28和P60显著低于青年组(P0.05)。3.免疫组织化学荧光染色结果:HSC70在小鼠脑内广泛表达,包括皮层、海马等脑区,在神经元(MAP2阳性染色)和星形胶质细胞(GFAP阳性染色)上均有表达,主要表达在胞浆;高龄组海马CA3区中HSC70蛋白表达较青年组降低。4.Western blot结果:青年组与高龄组在出生后1、3、7、14、21、28、60天检测海马HSC70蛋白表达,随着海马发育HSC70蛋白表达量逐渐增加,在28天达到峰值,第60天表达量有所下降;P28高龄组海马中HSC70蛋白表达量显著低于青年组(P0.001),P60的青年组与高龄组海马中HSC70蛋白表达量无显著性差异(P0.05);P28与P60的青年组小鼠经过水迷宫实验后海马中HSC70蛋白的表达量与水迷宫前均无显著性差异(P0.05),水迷宫实验后海马中HSP70蛋白的表达量与水迷宫前相比显著性增高(P0.05)。结论1.高龄雌性小鼠生育子代学习记忆能力下降。2.随着神经发育,小鼠海马中HSC70表达逐渐增高,到脑发育成熟期到达最高点。3.高龄雌鼠生育的子代小鼠在脑发育成熟期海马中HSC70表达低于青年生育子代,成年期两者无差异。
【图文】：

实验检测,青年,重复测量数据,多因素方差分析

图 1 定位航行实验检测逃避潜伏期A：P28 青年组与高龄组的逃避潜伏期。B：P60 青年组与高龄组的逃避潜伏期。（*：P < 0.05）B．游泳路程随着训练天数的增加，P28 和 P60 的青年组与高龄组找到平台的游泳距离均呈下降趋势。P28 小鼠在第 3、4、5 天高龄组找到平台的游泳距离显著高于青年组（重复测量数据的多因素方差分析，P < 0.05，图 2A），P60 小鼠在第 3、4、5 天高龄组找到平台的游泳距离显著高于青年组（重复测量数据的多因素方差分析，P < 0.05，图 2B）。

实验检测,青年,重复测量数据,多因素方差分析

【参考文献】