华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶克隆表达、组织定位及免疫学特性研究

发布时间：2020-03-29 06:30

【摘要】：目的通过对华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CsCysP38.3)功能和特性的研究,分析其在虫体与宿主之间所起作用,评价CsCysP38.3作为候选诊断抗原的价值和候选疫苗分子的可能性。方法根据GenBank上华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因(DQ902586.1)序列设计合成2对特异引物,提取华支睾吸虫成虫总RNA,逆转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,获得目的基因(CsCysP38.3);将目的基因与原核表达质粒pET-28a连接,构建重组质粒pET-28aCsCysP38.3,将重组质粒转化入BL21大肠杆菌中进行目的蛋白表达,并对获得重组蛋白Cs CysP38.3(rCs CysP38.3)进行纯化和复性。荧光免疫组化方法观察CsCys P38.3在华支睾吸虫成虫、后尾蚴和囊蚴阶段的组织定位。以rCsCysP38.3作为抗原,ELISA方法检测华支睾吸虫病人血清中特异IgG亚类和IgE,检测IgG1和IgG4检出率及交叉反应。用rCsCysP38.3免疫SD大鼠,在特异抗体滴度最高时进行囊蚴感染,通过计数大鼠粪便中虫卵数及成虫数来评价免疫保护作用。结果成功构建了pET-28a-CsCysP38.3重组质粒,原核表达产物rCsCysP38.3经纯化、复性后获得浓度为750μg/mL可溶性蛋白。荧光免疫组化结果显示CsCysP38.3在成虫定位于肠支,在后尾蚴定位于肠道、皮层和皮层细胞,在囊蚴定位于皮层和皮层细胞。rCsCysP38.3检测华支睾吸虫病人血清以IgG1和IgG4为主,特异IgG1检出率为33.3%(8/24例),IgG4检出率为58.3%(14/24例),主要与血吸虫和肺吸虫有交叉反应。rCsCysP38.3免疫大鼠后特异性IgG水平显著升高,至初次免疫后6周达高峰,效价高达1:1638400;在囊蚴感染后,免疫组与对照组的EPG(每克粪便虫卵计数)和寄生胆管成虫数经统计学处理无显著性差异,显示经rCsCysP38.3免疫后无明显抗虫感染的免疫保护作用。结论1.CsCysP38.3在成虫、后尾蚴定位显示该半胱氨酸蛋白酶可能参与了营养代谢功能,在囊蚴的定位提示可能与成囊和脱囊有关。2.rCsCysP38.3检测华支睾吸虫病人血清中特异IgG4效果尚可,可作为候选诊断抗原。3.rCsCysP38.3对囊蚴感染的免疫保护作用不明显。4.rCsCysP38.3具有较好的抗原性和免疫原性。
【图文】：

模板的 PCR 扩增产物（1ith adult cDNA. M, markDL组质粒双酶切鉴定（1.0%组质粒双酶切后；3，，pET2ducts and identification of rec0; Lane1, PCR produces; La; Lane3, pET28a digested by

21 1-2 PCR 产物及重组质粒双酶切鉴定（1.0%琼脂糖凝胶电泳PCR 产物；2，重组质粒双酶切后；3，pET28a 空质粒双酶切fication by PCR products and identification of recobinant plasmid bme. M, mark DL2000; Lane1, PCR produces; Lane2, recobinant plrestriction enzymes; Lane3, pET28a digested by restriction enzyme
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R383.22

【参考文献】

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本文编号：2605603